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HPLC几项关键性能技术指标的测试方法

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北纳创联邓思洁 2020-03-26 09:22 评论( 0 ) 浏览( 11 )

HPLC几项关键性能技术指标的测试方法

1、灵敏度的测试方法


HPLC的灵敏度可定义为:一、定量的物质,通过HPLC的检测器时,仪器所给出的信号大小就叫做该HPLC的灵敏度,有时也称为响应值。对使用者来讲,总是希望HPLC仪器有较高的灵敏度,因为灵敏度高,就意味着对等量的同一样品进行检测时,仪器有较大的输出信号。但是,灵敏度的高低,并不能表示HPLC仪器的检测能力。只有检出限,才能表示仪器的最大检测能力。


HPLC灵敏度的测试方法:主要根据信噪比的定义进行测试。一般取信号等于或大于噪声2倍时的检测量或浓度(信号强度)作为HPLC的信号大小。信号与噪声二者相除即为仪器的信噪比(灵敏度,但是要求S/N≧2)。


2、检测限测试方法


讲HPLC的指标、给出HPLC的谱图,应该实事求是的给出使用的灵敏度量程(一般使用最灵敏量程),给出样品浓度(一般是噪声的3倍左右),才能说明仪器的检测限或灵敏度。


3、光学类检测器噪声的测试方法


HPLC的噪声是一种与被测样品无关的、随机输出的信号。国际上对噪声的定义、测试方法各异。例如:美国材料协会制订的测试标准(ASTM),规定噪声分为长噪声、短噪声、和超短噪声三种。长噪声是指每小时内有6个至60个变化周期的噪声,所以,测定时间至少应该测试一小时;短噪声是指每小时内有1个至10个变化周期的噪声,所以,测定时间至少应该测试10分钟至60分钟内;超短噪声是指每分钟内有10个以上的变化周期的噪声,所以,测定时间应该大于1分钟。


从使用者的角度看,噪声又分为静态噪声和动态噪声。其测试方法如下:


1)静态噪声测试:冷态开机(关机2小时后开机),预热30分钟,连续测试1小时。在这1小时里,任取10分钟(包含最差的峰-峰值),在这10分钟里取峰对峰值(P-T0-P)的最大值,就是仪器的噪声。但是,10分钟里的峰对峰(P-T0-P)值,不同于10分钟里的任一地方的峰-峰(P-P)值,即:“10分钟里的峰对峰”值,不等于瞬时的峰-峰(P-P)值,测试数据前面应加“±”符号。


注意:开机30分钟后,仪器调整到最灵敏度档(如:对量程为0.005-3.0AUFS的仪器,取0.005AUFS,即纵坐标设置为0.005A);设置波长λ=250nm(有人设置500 nm,但最好测试250 nm);设置0 Abs(即时间扫描,吸光度从0点开始测试);光谱带宽(SBW)=2nm(固定光谱带宽的仪器不需选择)。


在上述条件下,连续测试1小时(用仪器上的CRT指示输出,或用数字电压表监测)。在1小时内,任取10分钟的峰对峰值(P-T0-P),其最大者前面加“±”符号,即是仪器的噪声。目前,国际上大多数科技工作者,基本上采用这种方法测试HPLC仪器的静态噪声。


有些科技工作者,认为在10分钟的峰对峰值(P-T0-P)前如果要加“±”符号,就应对峰-峰值的绝对值先除“2”。这种做法是不妥的,会低估仪器的噪声。因为噪声是随机的,可能是“+”值也可以是“-”值。


上述仪器条件的设置,在有些仪器上是不需要的,因为由于计算机的发展和普遍应用,很多仪器的坐标设置,完全由仪器的计算机自动设置。


2)动态噪声测试:


作者在研发检测器和使用HPLC时所采用的测试动态噪声方法如下:连接恒流泵、液相色谱分离柱和检测器。在恒流泵和检测器中有移动相(流动相)流动。


具体操作方法如下:


冷态开机,预热30分钟,设恒流泵的流速1mL/min;检测器设置:仪器调整到最灵敏度档(如:0.005AUFS;即纵坐标设置为0.005AU);波长λ=250nm(有人设置500 nm,但最好测试250 nm)、0 Abs(即时间扫描,吸光度和时间都从0点开始测试),光谱带宽(SBW)=2nm(固定光谱带宽的仪器不能选择),连续测试1小时,可以用仪器上的CRT指示噪声在这1小时里,任取10分钟(包含最差的峰-峰值),在这10分钟里取峰对峰值(P-T0-P)的最大值,就是仪器的噪声。但是,10分钟里的峰对峰(P-T0-P)值,不同于10分钟里的任一地方的峰-峰(P-P)值,即:“10分钟里的峰对峰”值,不等于瞬时的峰-峰(P-P)值。测试数据前面应加“±”符号。目前,国际上基本上采用这种方法测试HPLC仪器的动态噪声。有时候,为了节省时间,也可以在漂移测试的基础上检测噪声。但是开机时间就不是30分钟,而是2小时。这样所得测试数据稍小于开机30分钟的数据(因此,给出数据时要说明方法),数据处理方法仍如上所述。


3)目前国内外的HPLC制造商,往往在仪器样本上给出的都是检测器的静态噪声,同时注明了仪器的状态(检测器空池)。这样做,对于使用者了解整个仪器系统中的检测器性能有利,也是可以的。但是不符合使用者的总体要求,因为使用者的总体要求是:整个HPLC系统(包括泵、柱、检测器)处在使用状态(动态)的情况下,整机的噪声有多大。所以,作者认为静态噪声可以给出,也可以不给出,但是动态噪声必须给出。


注意:噪声测试时,国际接轨的做法是在500nm。但是有些厂商却给出700nm处测试的噪声,这也是不对的。因为波长短,能量大;500nm处的能量比700nm处大,所以在700nm处测试的噪声,数据会偏小,数据不真实。


4)中国的HPLC国家标准(2011版)和计量检定规程JJG705-2002也规定了噪声的测试方法,但是分别都还有一些值得推敲的问题,请大家自己参阅。


5)这里特别需要提出的是:目前有些国外HPLC生产厂商,为了吸引用户,制造了一些违背仪器学理论的指标。例如:国外某厂商,在招标中给出HPLC的噪声时,先采用计算机对噪声进行平滑,并且采用最大量程测试,结果给出的HPLC噪声非常小、谱图基线非常平直、谱峰尖而陡直,给人的印象是世界一流的HPLC。其实不然,给出的数据和谱图都是虚假的。如果用盲样进行比对测试,因为他们的HPLC的噪声大,信噪比差,灵敏度差,所以立即败下阵来。


我国三聚氰胺国标的建立过程中的比对测试结果就是如此,专家们从三家公司(两家外企,一家国产仪器公司(普析通用公司))的三种HPLC全方位比对测试的结果(标样由国家标物中心提供)中,最后选用了国产北京普析通用的早期HPLC产品L6作为国家建标的仪器(L6是《原料乳三聚氰胺快速测定--液相色谱法》国家标准中采用的唯一国产仪器),其根本原因是L6的比对测试数据准确可靠、噪声小、S/N高、性价比高等等。


4、稳定性(基线漂移和重复性)测试方法:


这里包括仪器的静态基线漂移和动态基线漂移的测试方法:


一般来说,使用者不关心单个检测器的静态指标,所以,可以不专门测试检测器的静态基线漂移。但是,作者认为设计、制造者应该测试静态基线漂移这个指标,测试方法与测试整机(系统)的动态基线漂移完全相同。


动态基线漂移测试方法如下:冷态开机,预热2小时,连续测试1小时。1小时内的最大最小值之差就是动态漂移。(也有测试更长时间的,例如作者在FLD检测器研发时,为了考察仪器的长时间漂移,连续测试48小时,仪器的漂移小于5mV)。


5、重复性及其测试方法:与漂移测试方法相同,对仪器进行多次测试(作者认为一般是5-7次),其数据的符合程度就是重复性,一般用RSD表示。


6、量程范围及其测试方法


1)定义


仪器能适用测量的范围或仪器能满足测量要求的范围叫量程范围。其表示方法为AUFS(Absorbance Unit Full Scale)或AU/FS(Absorbance Unit/Full Scale)。80年代以前,也有很多人用OD(光密度)这个概念表示Abs(Absorbance),即用ODFS来表示UVD的量程,但是OD不符合光对物质吸收的物理概念,不符合仪器学理论,所以,目前国际上已经废除“OD”概念,不能再使用“ODFS”了。


在实际的日常分析工作中,也有化学工作者用具体的化学物质来描述HPLC的量程。但是不同物质,由于摩尔吸光系数不同,表现出的灵敏度也不同,所以作者认为用具体的化学物质来描述HPLC的量程不符合仪器学理论的要求。作者认为,给出AUFS最合适,其最大优点是这种表示方法与样品的性质无关,便于比较同一类型检测器的性能优劣。但是这种表示方法对使用者来说不大直观、不大方便。目前,国际上的HPLC仪器的量程范围一般为:0.005-2.5AUFS(例如Waters的HPLC)。少数优质仪器的下限为0.001AUFS,但是有些仪器给出0.001-3.0AUFS的量程是有水分的,因为UVD的杂散光一般都比较大,而杂散光是光吸收类分析仪器主要分析误差的来源,它主要限制被分析样品浓度(吸光度)的上限。所以,HPLC的UVD给出0.001-3.0AUFS的量程一般是不准确的。


目前,国内外很多HPLC仪器的UVD生产厂商不给仪器的量程,这是不妥的。因为,不给量程范围就意味着不知道检测器的灵敏度(下限),不知道多少吸光度时仪器能达到满度。当然,目前有很多HPLC仪器的UVD生产厂商,给出了仪器对某一物质的最小检测浓度或最小检测量,这在某种程度上也可以反映仪器的灵敏度,并且对使用者来说,比较方便、比较直观。但是,这种表示方法只是对某一物质而言,特别是会带来样品处理产生的误差、容易低估仪器噪声的影响,因此,从仪器学理论的角度来看是不科学的。


2)量程范围测试方法


目前,国际上对HPLC的UVD的量程范围设计指标,一般在0.005-3.0AUFS内。作者在研制HPLC的UVD检测器时,用原上海大华仪表厂生产的XWT-204记录仪的1V档测试。当对数放大器的差分放大器的总输出为1V时,记录仪满度(100格)。当仪器的有效光电信号从0.005-3.0V时,均可保证对数放大器的输出为1V;此时,这个0.005-3.0V对应的吸光度为0.005-3.0Abs。要求从0.005-3.0Abs时,光度准确度都能保证在1%以内(即1V±10mv)。如此测量3次并取均值,即是HPLC的量程范围(0.005-3.AUFS)。


目前,国内外许多制造商都用萘或者蒽来测试HPLC系统的灵敏度,这种做法也可以,但是从仪器学理论角度考量,作者认为不科学。因为:①、不能给出仪器的测量范围,只能给出萘的最小检测浓度;②、试样的配制会带来很多误差;③、这种方法所作的测试,实际上是计算出来的灵敏度,而不是测试出来的真正的灵敏度,不能反应仪器真正的灵敏度。如果实际测试,肯定比计算的数据大很多。④、不与国际接轨,不便比较不同仪器的性能。虽说近几年国内外采用此方法的科技工作者比过去多,但是不能掩盖方法的局限性。所以,最好的方法还是给出仪器的测量范围。


还有人用静态噪声的2倍或3倍来计算最小检测浓度,这样计算出来的结果,同样是不真实的。因为从仪器学理论角度来看,一般在正常情况下,最小检测浓度是在系统处在动态的情况下测试的,所以计算最小检测浓度就必须用动态噪声,而不能用静态噪声。


还有人测试HPLC的最小检测浓度时,采用一些计算公式(如:Cmin=2NC/H×20,式中:Cmin 为最小检测浓度,N为仪器的噪声;C为浓度,H为峰高),计算时不考虑移动相的流速,这是不妥的。不考虑移动相的流速或计算公式中去掉移动相的流速,就意味着是静态的最小检测浓度,而使用者需要的是系统的动态最小检测浓度。所以作者认为这种计算方法很不合理,对使用者来讲是没有意义的,这种计算方法不可采用。

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