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H5亚型禽流感病毒目标分子片段的扩增、克隆与测序

【来源/作者】北纳创联 【更新日期】2015-08-22

一、H5亚型禽流感病毒命名

A/chlcken/Liaoning/1/2005(H5N1)

二、选择目标片段及克隆载体

H5亚型禽流感病毒血凝系(hemagglutimin,HA)具有良好的免疫原性-能诱导机体产生中和抗体,HA也是病毒发生抗原变异的主要蛋白之一,能诱导机体产生相应的中和抗体,因此.本标准样品选取主要HA全基因为目标,本标准样品不仅可以用作实验室的质量控制,同时还可以进行表达,对该蛋白的理化特性、致病机理及反向遗传操作都有重要的意义。

通常用于基因克隆表达的载体特别多,由于本研究中的AIV为RNA病毒,本标准样品特选用了PGEM—T载体,其含有T7启动子、SP6启动子和终止子,在T7聚合酶或SP6聚合酶的作用下直接进行体外转录,用于实验室的质量控制。

三、115亚型禽流感病毒目标分子片段的扩增、克隆与测序

(一)H5亚型禽流感病毒RNA的提取、扩增

离心管中加入TRIzol裂解液600 μL,样品200μL,同时设阳性对照、阴性对照。加入三氯甲烷200 μL震荡混匀.10000 g离心15 min;吸取上清液500μL加入到500μL异丙醇中,反复颠倒混匀,10000 g离心15 min;轻轻弃去上清,倒置于吸水纸上,尽量沾干液体.加入75%的酒精600μL.颠倒洗涤,10000 g离心10 min;轻轻弃去上清,倒置于吸水纸上,占干液体;4000 g离心10s,用微量加样器尽量吸干管底的液体,室温干燥3 min;加入11.5 μL的DEPC水,轻轻混匀,溶解管壁上的RNA,2000 g离心5s,4C保存备用。

(二)RT PCR

1.反转录体系

5×M—MLV Buffer                4μL

dNTPs(各2.5mmol/L)           2 μL

M-MLV(5U/μL)                   1μL

RNA酶抑制剂                    0.5μL

下游引物(20pmol/μL)            各1μL

模板RNA                        11.5μL

总反应体系为20 μL

2.反转录条件

42℃水浴1h--2h,直接进行PCR或放一20℃保存备用。

3.PCR扩增反应体系

10×PCR Buffer(含Mg 2+ )              2.5 μL

dNTPs(各2.5mmol/L)                  0.5 μL

Taq DNA聚合酶(5U/μL)                  1 μL

上游引物、下游引物(20pmol/μL)        各1 μL

反转录产物                             0.5 uL

用无菌水补充至25μL。

4.PCR扩增条件

94℃预变性3 min;

94℃变性1 min;

53℃退火1 min;

72℃延伸1.5 min。30个循环;

72℃5 min:

4℃保存。

5.PCR结果

如图4一1,有目的条带。

(三)目标基因的纯化

采用TaKaRa Agarose Gel DNA Purification Kit Ver.2.0试剂盒(货号DV805A).并按其操作说明回收目标分子DNA片段。

来源:北京标准物质网www.biaowu.com

 


【关键词】禽流感 基因克隆 北京标准物质网 

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