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真核表达系统的宿主菌和蛋白纯化方法

【来源/作者】北纳创联 【更新日期】2016-05-26

1. 酵母

由于大肠杆菌等原核表达体系所表达的蛋白质常以包涵体形式存在,其后续的变性溶解及复性等操作过程烦琐,不利于实际应用。而酵母是单细胞真核牛物,它既具有原核生物易于培养、繁殖快、成本低、便于基因工程操作等特点,又有比较完备的基因表达调控机制和对表达产物进行加工及翻译后修饰的过程,如二硫键的正确形成,前体蛋白的水解加工,糖基化作用等。因而以酵母为宿主建立的基因表达系统日益引起重视并得到广泛应用。根据不同酵母细胞的特点,已经建立了相应的表达载体和转化方法。

酿酒酵母很早就被应用于食品和饮料工业,也是至今了解最完全的真核生物,1996年完成的酿酒酵母基因组全序列测序工作,为进一步深入研究和利用奠定坚实的基础。酿酒酵母系统表达外源基因不产牛毒素,安全性好,已被美国FDA认定为安全性生物,此外由于酿酒酵母是真核生物,可以对蛋白进行翻译后加工,同时表达产物可分泌表达,易于纯化。然而酿酒酵母发酵时会产生乙醇乙醇的积累会影响酵母本身的生长,直接导致表达外源基因很难达到很高的水平。

此外,其分泌蛋白质效率低,对蛋白质的糖基化修饰不够理想,表达质粒易丢失。但是,由于酿酒酵母具有较高的安全性,在生产临床药剂方面仍占有重要的地位,例如用酿酒酵母做宿主表达的乙型肝炎疫苗、人胰岛素和人粒细胞集落刺激因子等基因工程产品均己正式上市。人们已在除酿酒酵母以外的许多酵母菌中发展出了多个性能优良的表达系统,这些酵母表达系统各有特点,并都在表达外源基因的实际应用中取得了很好的效果。

近年来,甲醇酵母,尤以巴斯德毕赤酵母使用最多、最广泛,已被认为是最具有发展前景的异源蛋白生产工具之一。毕赤酵母表达系统发酵密度可达到很高的水平,分泌蛋白质的能力强,糖基化修饰功能更接近高等真核生物,弥补了酿酒酵母的不足。发酵结束后,用玻璃珠机械磨碎菌体,裂解物经离心分离后,上清液随后进行离子交换层析、超滤、等密度离心以及分子凝胶过滤等纯化步骤,最终可获得高纯度的目的蛋白。

2. 动物细胞

虽然酵母等真核细胞能够进行糖基化,但由于这类细胞的糖基化酶不同,因此表达产物的寡糖链常与用哺乳动物细胞表达的不同,易被肝细胞巨噬细胞表面的受体识别而清除,因此用这类细胞表达的产品对人可能有免疫原性。而利用哺乳动物细胞进行蛋白表达则不存在这些问题,哺乳动物细胞能识别和除去外源基因的内含子,剪接加工成成熟的mRNA,其表达的蛋白质与天然蛋白的结构、糖基化类型和方式几乎相同且能正确组装成多亚基蛋白,可将表达的产物分泌到培养基中,提纯工艺简单。

动物细胞表达系统也是主要由宿主细胞和表达载体两部分组成,目前已有不少商品化的载体,人们可根据需要选择不同的载体、不同的增强子和启动子来获得外源基因的高效表达,如病毒载体和质粒载体。

虽然至今批准的由动物细胞表达的产品,其宿主细胞几乎都是CHO细胞。但是在实践中,发现它也存在着一些不足,如在其胞内存在着一种内肽酶,可以酶切表达产物。因此,近来一些具有良好特征的细胞系都已被作为宿主细胞试用于真核细胞的表达系统中,如BHK-21细胞,CHO-Kl细胞,C127细胞等。

3. 动物

随着基因工程技术的运用,一些药用蛋白产品亦可以通过转基因的哺乳动物细胞来生产。但是用动物细胞生产则成本高,难以满足需求。而用动物作为生物反应器正好满足了这些要求。动物的体液(不是固体组织)是获得重组蛋白的理想来源,因为体液是不断更新的,体液‘般有:血液、尿液、乳汁。在各种组织和器官中,作为生物反应器,乳腺具有巨大的优势。

目前,全球有数家公司在开展动物乳腺生物反应器的产业化开发。尽管动物乳腺生物反应器的研究和发展很快,但仍面临着一些问题,诸如生产效率低,基因整合效率不高,转基因动物死亡率高,常出现不育导致转基因传代难,无法大规模生产等,其相关研究难度高、效率低、时间长、费用高。

其中生产转基因动物效率低和外源基因表达受“位置效应”影响严重等技术瓶颈,是导致研究动物乳腺反应器困难的重要原因,而克隆技术可以将离体培养的、基因定点修饰后的动物体细胞转变成动物个体,可以很好地解决动物转基因效率低和基因表达方面的问题。因此,采用以体细胞克隆技术为核心的各种技术平台,可能是未来生产动物乳腺生物反应器动物的希望和必然趋势。

总之,随着基因重组技术的发展,已经由最初的原核表达系统发展到动物基因工程,相信随着科学技术的进步,会有越来越多的技术更好的服务重组蛋白的表达。


【关键词】肝细胞 巨噬细胞 CHO细胞 细胞系 atcc 北京标准物质网 

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