花生过敏原Arah1线性B细胞表位的鉴定（二）

2 结果与分析

2.1 花生中主要过敏原Ara h 1线性B细胞表位的氨基酸组成特性

在致敏蛋白结构数据库中获取花生主要过敏原Ara h 1的23 个线性B细胞表位序列，使用Bioedit软件分析各种氨基酸在23 个Ara h 1 线性B细胞抗原表位中的分布，Ara h 1的线性B细胞表位由19 种氨基酸组成，构成全序列的甲硫氨酸（Met，M）没有出现。天冬氨酸（Asp，A）、谷氨酸（Glu，E）、甘氨酸（Gly，G）、脯氨酸（Pro，P）和精氨酸（Arg，R）的出现频率较高；亲水性氨基酸和带电氨基酸（如Glu、Arg等）在Ara h 1线性B表位出现频率较高。

2.2 花生中主要过敏原Ara h 1线性B细胞表位二级结构分析结果

为了进一步探究Ara h 1的线性B细胞表位与其二级结构之间的关系，使用DSSP二级结构分析程序计算出二级结构的分布情况。Ara h 1线性B细胞表位的二级结构主要由α-螺旋、β-片层和β-折叠组成，具有一定的回转折叠构象，全长包含418 个氨基酸，对应于Ara h 1中氨基酸序列的170～587位，涵盖了10～22号线性B细胞表位。大多数线性B细胞表位各二级结构并没有明显的分布规律，且不同表位的二级结构相差较大，还需对其高级结构进行进一步分析。

2.3 花生中主要过敏原Ara h 1线性B细胞表位的高级结构

使用Cn3D软件将Ara h 1的10～22号线性B细胞表位标注于Ara h 1的空间结构上，深棕色单体的黄色区域。可以看到，大部分线性B细胞表位都位于单体之间的疏水相互作用结合区域，其结果也与线性B细胞表位的氨基酸组成分析结果一致性，即亲水性氨基酸在Ara h 1线性B表位中的出现频率较高。此外，有一部分线性B细胞表位埋入了Ara h 1三聚体的构象内部，不易被蛋白酶作用；另外，由于空间位阴效应，Ara h 1三级结构表现出B细胞表位被屏蔽，相比于那些露出甚至位于Ara h 1表面的表位，这些被屏蔽的表位可能需要经过变性后暴露出来才能发挥IgE结合活性。

2.4 花生主要过敏原Ara h 1抗消化片段

花生粗蛋白提取液在63 kDa处左右出现一条明显条带，其对应的是Ara h1。经不含胃蛋白酶的SGF和不含胰酶的SIF消化60 min后，其蛋白质条带未发生明显变化，说明提取的总花生粗蛋白在不含胃蛋白酶和胰酶的条件下具有热稳定性。经SGF、SIF消化30 s时，花生蛋白条带分布出现明显变化，大分子质量的条带变浅甚至消失，说明原样中的蛋白都被消化成小分子片段。在经SGF消化的整个过程中一直存在一条分子质量低于15 kDa的条带，在经SIF消化的整个过程中一直存在一条分子质量为10 kDa左右的抗消化片段。以上结果表明，花生提取物中的Ara h 1容易被胃蛋白酶和胰酶降解，但仍保留小分子片段，可能具有致敏活性。

对经过SGF或SIF消化60 min后的花生蛋白消化产物进行HPLC-MS/MS检测，鉴定出氨基酸长度超过4 个的抗消化肽段，并确定了多肽所属的蛋白质序列。花生粗蛋白经SGF消化后，共鉴定出28 条属于过敏原蛋白质的片段，其中有15 条与Ara h 1匹配。这15 条多肽覆盖了Ara h 1全序列的19.38%，且主要分布于蛋白质的氨基端。经SIF消化后，共检测出8 条属于过敏原蛋白的肽段，其中有4 条属于Ara h 1，覆盖了Ara h 1全序列的6.39%。

2.5 抗消化肽段及预测表位在Arah1氨基酸序列的定位

在Ara h 1氨基酸序列的94～104、299～313、330～337、401～426、505～510、532～543、560～572以及574～582位置的抗消化多肽均与预测的线性表位存在部分氨基酸序列的交叉，证明了部分表位的抗消化性。经SGF消化后可以获取比SIF消化更多的肽段信息，可能有助于鉴定更多的线性B细胞表位。

直线和波浪线.分别为抗SGF和SIF消化片段的氨基酸序列；红色、绿色.分别代表经胃蛋白酶消化、胰酶消化后预测的氨基酸序列；加粗的为绿色和红色重叠之处。

3 讨 论

本研究中采用生物信息学结合HPLC-MS/MS测定抗消化肽的方法共同检测分析Cupin超家族花生过敏原Ara h 1的线性B细胞表位。先通过过敏原结构数据库获取花生主要过敏原Ara h 1的线性B细胞表位序列，通过生物信息学分析软件归纳总结表位在氨基酸组成以及高级结构分布中的存在规律。分析发现，线性B细胞表位亲水性氨基酸含量较高。分析其二级结构，主要由α-螺旋、β-片层和β-折叠组成。分析其高级结构，IgE结合表位主要位于Ara h 1单体之间的疏水相互作用区域，有部分表位埋入三聚体构象内部。Ara h 1属于Cupin超家族，具有其典型的β桶状结构域。

Cupin超家族分为7S球蛋白三聚体和11S球蛋白六聚体，研究表明，7S和11S球蛋白虽然仅约有35%～45%的氨基酸序列相近，但在三级结构上具有高度的相似性。李平等分析了已经确定线性B细胞表位的Cupin家族食物过敏原，归纳出线性B细胞表位一般要具备的3 个特点：1）处于高度暴露于溶剂的区域；2）含有亲水性侧链，有利于与IgE抗体结合；3）有一定的柔韧性，便于抗原抗体的嵌合。这与本实验的分析结果一致。以上分析表明Cupin超家族的过敏原线性B细胞表位特点具有高度保守性，可将花生主要过敏原Ara h 1作为模式抗原，研究其他Cupin家族内过敏原的线性B细胞表位。

特定的食物致敏蛋白要引发过敏反应，必须在其经过加工处理或机体胃肠消化系统的作用后仍然具有抗原性。因此，目前发现的食物致敏蛋白大多具有良好的热稳定性及消化酶抗性。这意味着过敏原经消化后生成的多肽片段仍然具有足够数量的抗原表位。Prodic等研究发现花生通过口腔和胃中的酶消化后，其消化后的肽保留了过敏原能力，且从Ara h 1、Ara h 2和Ara h 3中鉴定出的大量抗消化短肽是连续表位序列的一部分，并具有相当大的致敏潜力，进一步证实了抗消化肽具有致敏潜力。另外，花生过敏原Ara h 1的结构也可能保护其抗原表位免受消化。为了确定Ara h 1四级结构是否在保护其免受蛋白水解作用中发挥一定作用，Maleki等将Ara h 1暴露于酸性条件下室温孵育1 h，孵育期结束时，进行Ara h 1单体之间的交联反应，并通过SDS-PAGE分析，结果表明即使在pH 2条件下孵育后，Ara h 1寡聚体仍然是稳定的，并且仍然可以结合IgE。

目前对于食物过敏原线性B细胞表位的研究主要应用重叠肽段合成法，其存在效率低下、合成肽段数目众多、盲目性较大的问题，不能对数目众多的食物过敏原进行高通量的预测与研究[26-28]。Wolff等鉴定发现含有71 个氨基酸的肽B为β-球蛋白上IgE结合区，为了确定结合位点的氨基酸序列，合成了长度分别为20 个和10 个氨基酸残基的重叠肽，这些肽的氨基酸序列与肽B的部分连续序列对应，通过免疫印迹法在这些重叠肽中鉴定出9 个IgE结合抗原表位。另外，Pedraza-Escalona等利用克隆出的鼠单克隆抗体和3 个人类单链片段抗Hev b 6.02与天然橡交乳交主要过敏原Hev b 6.02结合筛选分析Hev b 6.02的B细胞表位。

4 结 论

Ara h 1的线性B细胞表位富含亲水性氨基酸如精氨酸（Arg）、谷氨酸（Glu）、甘氨酸（Gly）以及天冬氨酸（Asp）等；分析其二级结构，Ara h 1线性B细胞表位的二级结构主要由α-螺旋、β-片层和β-折叠组成，具有一定的回转折叠构象；对其三级结构进行分析发现，表位主要位于单体之间的疏水相互作用区域，部分表位埋入三聚体构象内部。其抗消化序列与表位之间存在部分重叠。综上，质谱检测体外模拟胃肠道消化肽段，并结合表位生物信息学分析，可以作为鉴定线性B细胞表位的新方法，并可为鉴定Cupin超家族过敏原线性B细胞表位和低过敏性蛋白的制备提供参考。

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