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如表1所示,出现阳性反应的最高稀释度为1∶78 125,效价以出现阳性反应的样本最高稀释度表示,因此抗BSA-AEM-GAA多克隆抗体总效价为1∶78 125,结果说明免疫原的免疫接种取得了成功。总效价是衡量动物对免疫原整体应答效果的指标,并不能反映出针对半抗原的应答效果,针对半抗原的应答效果需要测定半抗原特异性抗体的效价。
表1 抗BSA-AEM-GAA多克隆抗体总效价的测定结果
注:+.阳性;-.阴性。下同。
由表2可知,抗BSA-AEM-GAA多克隆抗体能够与包被原BSA-AEM-出现阳性反应,而与包被原OVA-AEM-反应阴性,说明其中不存在靶向图1中3号位的抗体,但是可能存在靶向图1中1号位及2号位的抗体,与包被原BSA的阳性反应证实了靶向图1中1号位抗体的存在。经过BSA吸收处理的多抗与包被原BSA的反应阴性,但是与包被原BSA-AEM-的反应依然阳性,也证实了靶向图1中2号位抗体的存在。抗BSA-AEM-GAA多抗与包被原OVA-AEM-GAA出现阳性反应,但是与OVA-AEM-呈现阴性反应,因此可以推断多克隆抗体中存在靶向图1中4号位或5号位的抗体。经过GAA吸收处理的多抗与包被原OVA-AEM-GAA的反应阴性,证实了靶向图1中5号位抗体的存在,也否定了靶向4号位抗体的存在。因此,在经过靶向分析后,明确了抗BSA-AEM-GAA多克隆抗体中含有靶向BSA、GAA以及BSA与联接部结合点等区域的抗体。
表2 抗BSA-AEM-GAA多克隆抗体的靶向分析结果
图1 抗偶联抗原的多克隆抗体中各独特型抗体靶向位置示意图
如表3所示,多抗样本出现阳性反应的最高稀释度为1∶3 125。由表3可知,以OVA-AEM-GAA作为包被原,抗BSA-AEM-GAA多抗样品中只有抗灵芝酸A抗体能够参与反应,因此抗BSA-AEM-GAA多抗中灵芝酸A特异性抗体效价为1∶3 125。灵芝酸A特异性抗体效价与总效价相比明显降低,但其含量足以用于灵芝酸A的酶联免疫吸附测定,说明本实验对灵芝酸A免疫原的合成获得成功,其能够激发动物免疫系统对灵芝酸A足够的应答强度。
表3 灵芝酸A特异性抗体效价的测定结果
按照1.3.6节方法采用间接竞争酶联免疫吸附测定法,灵芝酸A每一剂量组的相对吸光度、组间差异显著性及CV结果。选取与0 μg/L及2 000 μg/L剂量组吸光度均表现为显著差异的剂量组(0.3、0.9、2.7、8.1、24、72 μg/L)数据进行曲线拟合,Y表示相对吸光度,X表示灵芝酸A质量浓度,在对数函数模型下,取得较好的拟合效果,回归方程:Y=-15.45lnX+71.424,R2=0.988 7。如果X轴以灵芝酸A质量浓度的自然对数表示,可以得到线性回归方程:Y=-15.454X+178.17,R2值相同。计算出灵芝酸A的IC50为4.0 μg/L,IC20为0.6 μg/L,IC80为27.3 μg/L,IC10为0.3 μg/L。确定该测定方法的线性范围(IC20~IC80)为0.6~27.3 μg/L,检出限(IC10)为0.3 μg/L。经过比较,该法用于灵芝酸A的测定比高效液相色谱法、液相色谱-串联质谱法及免疫层析法具有更低的检出限,与Sakamoto等构建的酶联免疫吸附测定法相比,检出限低1 个数量级,且反应用时更短。
根据线性范围,将灵芝酸A分为0.6、1.5、4.0、10.5、27 μg/L剂量组,通过间接竞争酶联免疫吸附测定法,制备出灵芝酸A测定的工作曲线,得到线性回归方程:Y=-16.177X+184.84,Y表示相对吸光度,X表示灵芝酸A质量浓度的自然对数值,R2值可达0.996 4,表明该工作曲线具有较高的拟合度。
样品加标前后5 批次实验测定,加标样品与不加标样品5 个批次测定结果的批间CV均小于10%,样品加标回收率在82.9%~118.6%之间,不同批次的测定结果说明该方法对样品中灵芝酸A测定具有较好的重复性,加标回收率结果说明该方法对样品中灵芝酸A测定具有较高的准确度。
通过间接竞争酶联免疫吸附法对22 份灵芝粉剂产品的测定结果见表6。不同品牌灵芝粉剂产品中灵芝酸A含量存在较大的差异,相差可以达到100 倍以上。进一步进行数据分析发现,不同类别的灵芝粉剂产品之间,灵芝酸A含量的差异显著性有所不同,其中破壁灵芝孢子粉与灵芝孢子粉的组间差异不显著(P≥0.05),而灵芝粉与破壁灵芝孢子粉及灵芝孢子粉的组间差异极显著(P≤0.01),即便是同一类别的产品,不同品牌间的组间差异性也是极显著(P≤0.01),这种结果在灵芝粉、破壁灵芝孢子粉及灵芝孢子粉3 类产品中都存在。
图2 酶联免疫吸附测定法与高效液相色谱法测定比较
将上述22 种产品采用高效液相色谱法进行灵芝酸A的测定,两种方法的测定结果对比图见图2。经数据分析,酶联免疫吸附测定法与高效液相色谱法的测定结果相比,相关系数r=0.972,由此可见,本实验所建立的间接竞争酶联免疫吸附测定法对样品中灵芝酸A的测定结果具有较高的可信度。
灵芝保健品市场中,同一类别和相同质量的产品,价格可以相差10 倍以上,价格与质量相关性,以及性价比,会让消费者难以抉择。本研究选用灵芝酸A作为评估灵芝产品质量的检测指标,是考虑到灵芝酸A在不同品种的灵芝中普遍存在,在灵芝三萜中占有比例最大、稳定性好,而且其经过验证的抗氧化、抗肿瘤、抗辐射、缓解哮喘及抗疲劳等多种生物学活性基本上可以代表灵芝的功效。然而,灵芝的功效因子不止一种,某种药效的作用或许是多种因子共同作用的结果,所以单独用灵芝酸A作为评估灵芝产品质量的指标有不完善之处。当前灵芝酸A测定还主要是依赖高效液相色谱等专业化的分析仪器,运行成本及技术要求都比较高,酶联免疫吸附测定法是基于抗原-抗体反应的测定方法,反应条件温和又具有较高的灵敏度,对仪器专业化要求也不高,而且能够开发出商业化试剂盒,便于基层的应用,所以利用酶联免疫吸附法测定灵芝酸A是一个可以考虑的选项。
在酶联免疫吸附测定法中,只有靶向半抗原的抗体才是测定目标物所必需抗体,如果包被原选择不当,多抗中靶向其他区域的抗体与包被原反应会影响到测定的灵敏度或者使测定不能开展。在做小分子目标物酶联免疫吸附测定时,通常是将包被原与免疫原采用不同的载体,往往就能够得到理想的效果,然而如果多抗中存在靶向与联接部有关的抗体,只更换载体则无法保证实验的正常进行,这也是本实验中遭遇失败的经验总结,所以多克隆抗体的靶向分析有一定的必要性。在抗体制备技术中,单克隆抗体与基因工程抗体具有更高的技术含量,但是在酶联免疫吸附测定法中,只要包被原选择合理或者多抗经过适当处理,利用多克隆抗体构建的测定方法在灵敏度与特异性方面并不低于单抗与基因工程抗体,而且具有更低的成本。
利用活化酯法合成BSA-AEM-GAA作为免疫原,接种实验兔获得了兔抗BSA-AEM-GAA的多克隆抗体,经过对多克隆抗体总效价及灵芝酸A特异性抗体效价的测定,证明免疫原的合成及动物免疫接种都获得了成功。本研究还利用多克隆抗体构建了灵芝酸A测定的间接竞争法酶联免疫吸附法,对所构建测定方法的可重复性、样品回收率进行测定,结果证明该方法对样品中灵芝酸A测定具有较好的可重复性和较高的准确度。本研究利用构建的间接竞争酶联免疫吸附法对市场上22 份灵芝粉剂产品进行测定,测定结果与高效液相色谱法结果具有较强的相关性,证明该方法用于灵芝酸A的测定具有较高可信度。上述结果表明本研究构建的方法用于灵芝酸A测定具有可行性,该方法能够为灵芝保健品市场中相关产品的质量监控提供一种辅助手段。
相关链接:灵芝酸A,抗原,灵芝,牛血清白蛋白,肿瘤,3,3’,5,5’-四甲基联苯胺,北纳生物
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