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近年来,市场上出现一些不法商家在暴利驱使下,制造、销售添加了苯甲酸钠的“注水肉”,注水后的肉易造成微生物污染,不法商家添加苯甲酸钠,达到杀菌防腐效果,减缓生鲜肉的腐败。注水肉现象屡禁不止,2014年兴化市一家屠宰场被举报给活猪注水,通过增加猪肉质量非法盈利。2017年锦州市某镇肉联厂向待屠宰的生猪注水,同时注射盐酸肾上腺素针剂,生产、销售大量“注水猪肉”。2018年报道发现注水时加入保水药和消炎药等新作案手法。注水肉不仅损害消费者的利益,更会引入非肉源性污染物威胁消费者的健康。目前尚无针对生鲜肉中苯甲酸钠及代谢物的检测方法。为严厉打击非法注水肉行为,亟需建立生鲜肉中苯甲酸及其代谢物的检测方法,为执法提供技术支撑。
目前国内外关于苯甲酸和马尿酸检测方法的研究报道主要采用毛细管电泳法、气相色谱法、高效液相色谱法以及高效液相色谱-串联质谱法。GB 5009.28ü2016《食品中苯甲酸、山梨酸和糖精钠的测定》中仅规定了一般食品中苯甲酸的液相色谱和气相色谱检测方法。气相色谱法前处理操作繁琐、耗时较长,高效液相色谱法灵敏度较低、定性能力较差,阳性样品通常需要进行质谱确证,用于多组分复杂基质的同时测定难以克服基质干扰的不足。而高效液相色谱-串联质谱联用技术一般采用多反应监测方式,不但抗干扰能力强、操作简便、选择性强,准确度和灵敏度也高,逐渐成为多组分高通量痕量、微量分析的重要方法。目前,国内外针对苯甲酸和马尿酸的研究中,采用检测的样品基质并未涉及新鲜畜肉及内脏,且未有同时检测苯甲酸和马尿酸的超高效液相色谱-串联质谱检测方法。
现有国家标准中也没有专门针对生肉样品的前处理方法,已有文献报道的动物源食品基质多为肉制品和乳制品,主要通过水相提取、沉淀剂沉淀蛋白除杂,而生肉样品中不仅含蛋白还包括磷脂、酶等复杂成分,如何有效减少样品杂质干扰是畜肉及内脏样品前处理的难点。随着固相萃取小柱填料的发展,固相萃取技术发挥较大优势,如避免乳化现象、操作简单方便、溶剂消耗少、回收富集效率高、重复性好,被广泛应用于多个领域。因此,本实验专注于畜肉及内脏样品前处理条件优化,通过固相萃取技术净化样品,建立能够检测畜肉及内脏中苯甲酸和马尿酸的超高效液相色谱-串联质谱检测方法。本检测方法能够高通量、快速检测畜肉及内脏中的苯甲酸和马尿酸,可用于评估监测饲用苯甲酸的畜肉食品安全,为执法机关监管违法添加苯甲酸的行为提供有力技术支撑。
甲醇、乙腈、甲酸、乙酸铵(均为色谱纯) 德国CNW公司;乙腈、甲醇、乙酸(均为分析纯) 国药集团化学试剂有限公司;水为一级水。
对照品:苯甲酸钠(纯度98.94%) 德国Dr.Ehrenstorfer GmbH公司;马尿酸(纯度98%) 德国CNW公司。
PRiME HLB固相萃取柱(60 mg/3 mL)、HLB固相萃取柱(60 mg/3 mL)、MAX固相萃取柱(60 mg/3 mL) 沃特世科技(上海)有限公司;C18固相萃取柱(500 mg/3 mL)、PAX固相萃取柱(200 mg/3 mL)、PWAX固相萃取柱(200 mg/3 mL)天津博纳艾杰尔科技有限公司;ExionLC高效液相色谱-QTRAP 5500串联四极杆质谱仪 美国AB SCIEX公司;AUW220电子天平(分度值0.1 mg) 日本Shimadzu公司;S-100涡旋仪 日本Taiyo公司;离心机日本Hitachi公司;Milli-Q纯水仪 美国Millipore公司;固相萃取装置 美国Agilent公司;HGC-24A氮吹仪天津恒奥科技发展有限公司。
标准溶液:准确称取对照品,折算成苯甲酸、马尿酸各10 mg(精确至0.000 1 g),置于100 mL烧杯中,加适量甲醇溶解,用甲醇转移并定容至刻度,摇匀,配制成质量浓度为100 mg/L标准储备液。置于-18 ℃以下冰箱中保存。
混合标准溶液:分别吸取苯甲酸、马尿酸标准储备液适量,用甲醇配制成混合标准溶液,置于-18 ℃以下冰箱中保存。
标准工作溶液:使用时将上述混合标准溶液用甲醇-水(1∶1,V/V)逐级稀释为标准工作溶液。临用现配。
取空白或供试动物组织样品,绞碎,均质,得空白或试样。称取样品2 g(精确至0.01 g)于50 mL离心管中,加入10 mL甲醇,加盖后涡旋提取20 min,4 ℃、12 000 r/min离心5 min,将2 mL上清液过PRiME HLB固相萃取柱,接收流出液,并用2 mL甲醇洗脱,收集全部流出液,在40 ℃以下氮气吹近干至0.5 mL,加入0.5 mL水,涡旋复溶,过0.22 μm滤膜,供测定。
色谱条件:Phenomenex Luna Omega Polar C18色谱柱(2.1 mmh100 mm,3 μm);柱温30 ℃;进样体积5 μL;流动相:A为5 mmol/L乙酸铵(含0.1%甲酸);B为乙腈;流速0.4 mL/min。洗脱梯度见表1。
表1 梯度洗脱程序
质谱条件:电喷雾离子源(electrospray ionization,ESI)负离子模式(ESI-);离子化电压4 500 V;气帘气压力30 psi;雾化气压力55 psi;辅助气压力60 psi;雾化温度550 ℃;多反应监测参数见表2。
表2 苯甲酸和马尿酸的多反应监测质谱参数
注:*.定量离子。
相关链接:苯甲酸,马尿酸,甲酸,乙酸铵,乙腈,氮气,甲醇,北纳生物
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