超高效液相色谱法检测畜肉中苯甲酸残留（二）

2 结果与分析

2.1 仪器条件的优化

液相色谱条件的优化主要考察色谱柱和流动相对目标化合物的保留和分离情况。实验过程中比较不同的色谱柱Phenomenex Luna Omega Polar C18（2.1 mmh100 mm，3 μm）、Phenomenex Kinetex C18（3.0 mmh50 mm，2.6 μm）、Agilent SB-AQ（3.0 mmh100 mm，1.8 μm）对化合物分离效果的影响。如图1B所示，使用Agilent SB-AQ色谱柱时，在苯甲酸出峰处左边有1 个干扰峰。使用Kinetex C18色谱柱时，苯甲酸峰形不佳（图1A）。Phenomenex Luna Omega Polar C18色谱柱不仅能使化合物完全分离，还能有效减少杂质对苯甲酸和马尿酸的干扰。Luna Omega Polar C18色谱柱填充了具有极性基团修饰的颗粒，其表面增强了极性保留能力，对苯甲酸和马尿酸保留和分离效果好。为使化合物峰形更佳，响应更高，本实验考察在水相为纯水、5 mmol/L乙酸铵溶液和5 mmol/L乙酸铵（含0.1%甲酸）溶液，有机相为乙腈的流动相体系下，苯甲酸和马尿酸的出峰情况。

结果表明，水相为纯水时，苯甲酸和马尿酸出峰时间较早，并且苯甲酸出峰时间右侧有1 个干扰峰（图1D）；水相为5 mmol/L乙酸铵溶液时，苯甲酸未出峰，可能是乙酸铵溶液抑制了其电离（图1C）。通过加入一定量甲酸调节流动相5 mmol/L乙酸铵溶液的pH值，使目标化合物出峰时间后移，从而减少洗脱杂质对目标物的影响，更好地改善峰形，得到对称的尖峰。因此，本实验选择含0.1%甲酸的5 mmol/L乙酸铵溶液作为流动相水相。

图1 不同液相色谱条件下化合物的离子流图

A.Kinetex C18色谱柱；B.Agilent SB-AQ色谱柱；C.流动相水相为5 mmol/L乙酸铵溶液；D.流动相水相为纯水；下标1～3.分别为总离子流图、马尿酸、苯甲酸。

如图2所示，苯甲酸和马尿酸的结构中均含有羧基，苯甲酸钠以钠盐形式存在，在极性溶剂中易失去氢离子形成带负电荷的基团[M－H]－，因此选取负离子模式对化合物混合标准溶液进行全扫描，以确定分子离子峰。然后进一步碎裂母离子，并对子离子进行全扫描。在此基础上，选择2 个丰度较高、峰形好、干扰小的特征子离子，并优化去簇电压和碰撞能量等参数，最终选定定量分析条件，结果见表2。苯甲酸和马尿酸的离子流图见图3。

图2 目标化合物的结构式

图3 苯甲酸（200 ng/mL）和马尿酸（40 ng/mL）的离子流图

a.总离子流图；b.苯甲酸m/z 121.0/77.0；c.苯甲酸m/z 121.0/121.0；d.马尿酸m/z 178.1/77.0；e.马尿酸m/z 178.1/134.0。

2.2 样品前处理条件优化

2.2.1 提取溶剂的选择

苯甲酸和马尿酸属于极性化合物，根据相似相溶原理，采用极性溶剂进行样品提取。对比甲醇、乙腈、甲醇-水（1∶1，V/V）、乙腈-水（1∶1，V/V）、甲酸-甲醇-水（0.02∶1∶1，V/V）、甲酸-乙腈-水（0.02∶1∶1，V/V）作为提取溶剂时的提取效率。如图4所示，甲醇作为提取溶液时对苯甲酸的提取效果最好，乙腈和甲醇-水（1∶1，V/V）次之。对马尿酸提取效果依次为甲醇-水（1∶1，V/V）＞甲酸-乙腈-水（0.02∶1∶1，V/V）＞乙腈-水（1∶1，V/V）＞甲醇。在甲醇-水和乙腈-水体系下马尿酸提取率较纯有机相更高，说明加入一定比例的水，有利于马尿酸的提取。此外，实验结果表明加入甲酸并不能提高对苯甲酸和马尿酸的提取效率。综上，甲醇和甲醇-水（1∶1，V/V）对苯甲酸和马尿酸提取效果更佳。

为进一步优化溶剂对目标化合物的提取，考察不同比例甲醇和水体系下，甲醇、甲醇-水（75∶25，V/V）、甲醇-水（50∶50，V/V）、甲醇-水（25∶75，V/V）以及纯水对苯甲酸（加标量1 mg/kg）和马尿酸（加标量0.2 mg/kg）的提取回收效果。以上几种提取溶剂对马尿酸的提取效果差别不大，回收率在100%～115%之间。而提取溶剂为甲醇时，苯甲酸回收率最高，达到90%以上。为有效提取两种目标化合物，本实验选择甲醇作为提取溶剂。

2.2.2 净化方法的优化

虽然样品在提取、离心过程中去除了大部分脂肪、蛋白，但提取溶液中仍含有大量杂质，还需进一步净化。相较于液液萃取等净化方式，固相萃取柱净化可以有效保留目标物，去除多余杂质，因此选取固相萃取柱对其进行富集、除杂。净化过程中，不同类型固相萃取柱对目标化合物的保留程度不同，本实验选取6 种固相萃取柱，对比苯甲酸1 mg/kg、马尿酸0.2 mg/kg添加水平下的回收率。如图6所示，PRiME HLB小柱能够有效减少畜肉及内脏样品中磷脂等杂质的干扰，使苯甲酸和马尿酸得到高回收率。HLB具有一定比例的亲水基，能够有效萃取极性酸性化合物，对苯甲酸和马尿酸吸附效果好，但用甲醇洗脱时，苯甲酸未能全部洗脱下来，回收率约为57%。

C18反相固相萃取小柱对苯甲酸和马尿酸吸附效果均较差，水相上样和淋洗时大部分流出，导致基本无回收。混合型阴离子色谱柱MAX和PAX具有强阴子交换作用，对苯甲酸和马尿酸具有较强的吸附保留，但由于苯甲酸的苯环与羧基共轭，形成较为稳定的苯甲酸负离子，吸附剂作用强，较难洗脱，从而导致回收较差。弱阴离子交换柱PWAX与强阴离子交换柱相比，与苯甲酸作用相对较弱，洗脱回收更好。虽然阴离子交换固相萃取小柱对马尿酸的回收率大于90%，但对苯甲酸的回收率均小于70%。综上所述，本实验选择PRiME HLB对样品进行净化，苯甲酸和马尿酸回收率分别约为105%和98%。

2.3 方法学验证

2.3.1 线性范围、检出限和定量限

该方法采用外标法定量分析，配制苯甲酸和马尿酸系列混合标准溶液进行分析，在苯甲酸20～1 000 ng/mL和马尿酸4～200 ng/mL质量浓度范围内线性关系良好，线性相关系数均大于0.99，线性范围良好。以3 倍信噪比及10 倍信噪比确定检出限及定量限，本方法马尿酸检出限和定量限分别为2.5 μg/kg和10 μg/kg，苯甲酸检出限12.5 μg/kg和定量限50 μg/kg，远低于GB 5009.28ü2016《食品中苯甲酸、山梨酸和糖精钠的测定》中液相色谱法检测苯甲酸的检出限（0.005 g/kg）和定量限（0.01 g/kg），有利于低含量苯甲酸的检测，具有明显优势。

2.3.2 准确度及精密度

向畜肉及内脏中按定量限、2 倍定量限和10 倍定量限浓度水平加入苯甲酸和马尿酸标准溶液，每个添加量分别做6 个平行，通过提取净化后测定其含量，计算回收率确定方法的准确度，并计算测定结果相对标准偏差（relative standard deviation，RSD）评价方法精密度。两种化合物的回收率在70.5%～99.7%之间，精密度RSD在0.3%～7.1%之间（n=6），均小于8%，其精密度和回收率均符合实验要求。

2.3.3 重复性和稳定性

为考察方法重复性，由3 个不同实验人员重新取苯甲酸和马尿酸3 个不同质量浓度样品溶液，计算测定结果RSD，重复性实验中苯甲酸和马尿酸RSD为1.1%～5.8%。在方法稳定性实验中，日内稳定性实验中对同一个样品在1 d内检测5 次，计算RSD，其范围为2.0%～6.9%。日间稳定性实验中对同一个样品在1 d内检测1 次，检测3 d，计算RSD，其范围0.7%～7.2%。结果表明该方法具有良好的重复性和日内、日间稳定性。

2.4 实际样品检测

采用超高效液相色谱-串联质谱法对收集的5 个可疑牛肉样品进行检测，马尿酸均有检出，其中1 个牛肉样品中马尿酸含量较高，为0.013 6 g/kg；4 个样品苯甲酸检出量均超过0.010 0 g/kg，2 个样品苯甲酸检出结果甚至超过0.300 g/kg，均超过了美国农业部食品安全检验局对苯甲酸和苯甲酸钠用于畜禽产品的最大限量0.01 g/kg。

通过该方法对市售75 个样品进行检测，包括猪肉27 个、猪肝16 个、牛肉16 个、羊肉6 个、猪肾5 个和羊肾5 个。猪肉样品中苯甲酸检出率为44%，牛肉样品中苯甲酸检出率为50%，6 个羊肉样品均有检出，其中1 个猪肉样品苯甲酸检出量较高，为0.006 04 g/kg，2 个牛肉样品苯甲酸检出量较高，分别为0.019 3 g/kg和0.130 g/kg，其他样品苯甲酸检出量为52.1～198.0 μg/kg。对于马尿酸，猪肉样品中马尿酸检出率为67%，含量为30.4～251.0 μg/kg，牛肉样品中3 个样品马尿酸未检出，其余样品马尿酸检出量为25.3～726.0 μg/kg，羊肉中马尿酸检出量为193～674 μg/kg。此外，猪肝样品中苯甲酸检出量为60.5～403.0 μg/kg，马尿酸检出量为25.6～653.0 μg/kg。猪肾和羊肾样品苯甲酸检出量分别为960～5 276 μg/kg和407～690 μg/kg，马尿酸检出量分别为2 401～13 192 μg/kg和1 018～1 725 μg/kg，远高于猪肉和羊肉样品。实验结果表明，在畜肉及内脏中苯甲酸和马尿酸检出率相对较高，可能存在非法添加和过量使用饲用苯甲酸现象，且存在较大风险。

3 结 论

建立畜肉及内脏中苯甲酸和马尿酸残留的超高效液相色谱-串联质谱检测方法。该方法经甲醇涡旋提取，PRiME HLB净化，前处理操作简单、方便，上机检测时间5.5 min，快速、高效。加标实验中，在猪肉和猪肝基质中回收率在70.5%～99.7%之间。苯甲酸检出限为12.5 μg/kg、定量限为50 μg/kg，远低于GB 5009.28ü2016中液相色谱法检测苯甲酸的检出限（0.005 g/kg）和定量限（0.01 g/kg），可用于低含量苯甲酸的检测。方法学考察结果表明，该方法准确、可靠，具有良好的重复性和稳定性，可适用于大批量畜肉及内脏样品的监测分析。

目前，国家标准并无针对畜肉及内脏中苯甲酸及代谢物马尿酸残留的检测方法，且未对畜肉及内脏中苯甲酸及马尿酸残留限量进行规定，不利于执法机构对违法注水添加苯甲酸及钠盐和过量饲用苯甲酸的行为进行监管。本方法的建立弥补了检测方法的空缺，为打击违法添加苯甲酸行为提供有力的技术支撑，对保障畜肉及内脏食品安全具有重要意义。

相关链接：苯甲酸钠，乙酸铵溶液，乙腈，马尿酸，山梨酸，糖精钠，甲酸，甲醇，北纳生物

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