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实时荧光定量PCR结果分析,教你从菜鸟到高手

小词字-会员头像-www.biaowu.com标准物质网 小词字 0 779 2020-01-15
【摘要】实时荧光定量PCR技术(Real-Time Quantitative PCR)是指在PCR反应体系中加入荧光基团,利用荧光信号积累实时监测整个PCR进程,最后通过标准曲线对未知模板进行定量分析的方法。
  • 在对荧光定量PCR结果进行分析时首先要了解几个概念:

      基线(Baseline)指在PCR扩增反应的最初数个循环里,荧光信号变化不大,接近一条直线,这样的直线即基线。

      光域值threshold的设定,一般将PCR反应前15个循环的荧光信号作为荧光本底信号,荧光域值是PCR3-15个循环荧光信号标准差的10倍,荧光域值设定在PCR扩增的指数期。

        CT值表示每个PCR反应管内荧光信号到达设定的域值时所经历的循环数。研究表明,各模板的CT值与该模板的起始拷贝数的对数存在线性关系,起始拷贝数越多,CT值越小,反之亦然。

      融解曲线是用来验证扩增产物特异性的,如果产物是单一条带,融解曲线就会出现一尖峰;如果有引物二聚体或其它非特异性扩增,就会出现至少两个尖峰。

    Real-Time qPCR 常见问题分析

    1.无Ct值出现

    1)检测荧光信号的步骤有误:一般SG法采用72℃延伸时采集,Taqman法则一般在退火结束时或延伸结束采集信号;

    2)引物或探针降解:可通过PAGE电泳检测其完整性;

    3)模板量不足:对未知浓度的样品应从系列稀释样本的最高浓度做起;

    4)模板降解:避免样品制备中杂质的引入及反复冻融的情况。

    2.Ct 值出现过晚(Ct>38)

    1)扩增效率低:反应条件不够优化,设计更好的引物或探针、改用三步法 进行反应、适当降低退火温度、增加镁离子浓度等;

    2)PCR各种反应成分的降解或加样量不足,

    3)PCR产物太长:一般采用80-150bp的产物长度。

    3.标准曲线线性关系不佳

    1)加样存在误差:使得标准品不呈梯度;

    2)标准品出现降解:应避免标准品反复冻融,或重新制备并稀释标准品;

    3)引物或探针不佳:重新设计更好的引物和探针;

    4)模板中存在抑制物,或模板浓度过高。

    4.负对照有信号、溶解曲线不止一个主峰

    1)引物设计不够优化:应避免引物二聚体和发夹结构的出现;

    2)引物浓度不佳:适当降低引物的浓度,并注意上下游引物的浓度配比;

    3)镁离子浓度过高:适当降低镁离子浓度,或选择更合适的mix 试剂盒;

    4)模板有基因组的污染:RNA提取过程中避免基因组DNA 的引入,或通过引物设计避免非特异扩增。

    5.扩增效率低

    1)反应试剂中部分成分特别是荧光染料降解;

    2)反应条件不够优化:可适当降低退火温度或改为三步扩增法;

    3)反应体系中有PCR反应抑制物:一般是加入模板时所引入,应先把模板适度稀释,再加入反应体系中,减少抑制物的影响。
     

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