该方法采用高效液相色谱法测定维生素D3的含量。
一、方法原理：供试品和内标均制成甲醇溶液，进入高效液相色谱仪进行色谱分离，用紫外吸收检测器，于波长254nm处检测维生素D3（C27H44O）和内标邻苯二甲酸二甲酯的吸收值，计算出其含量。
二、试剂：
1.异辛烷
2. 正己烷
3. 正戊醇
三、仪器设备：
1. 仪器
1.1 高效液相色谱仪
1.2 色谱柱
硅胶为填充剂，维生素D2峰与内标物质峰的分离度应符合要求。
1.3 紫外吸收检测器
2. 色谱条件
2.1 流动相：正己烷+正戊醇=997:3
2.2 检测波长：254nm
2.3 柱温：室温
三、试样制备：
1. 称取供试品
精密称取该品25mg，置100mL棕色量瓶中。
2. 对照品溶液的制备
精密称取维生素D3对照品和维生素D3对照品25mg，置100mL棕色量瓶中，加异辛烷80mL，避免加热，超声处理1分钟使完全溶解，并加异辛烷至刻度，摇匀，冲氮密塞，避光，0℃以下保存。
3. 内标溶液的制备
取邻苯二甲酸二甲酯25mg，置25mL量瓶中，加正己烷溶解并稀释至刻度，即得。
4. 供试品溶液的制备
上述供试品加三甲基戊烷80mL，避免加热，用超声处理1分钟使溶解，加三甲基戊烷稀释至刻度，摇匀，即得供试品溶液。
注：“精密称取”系指称取重量应准确至所取重量的千分之一。“精密量取”系指量取体积的准确度应符合国家标准中对该体积移液管的精度要求。
四、操作步骤：
分别精密吸取上述供试品溶液与对照品溶液，20μL 注入高效液相色谱仪，用紫外吸收检测器，于波长254nm处测定维生素D3和内标邻苯二甲酸二甲酯的吸收值，按内标法以峰面积计算，即得。