竹节参总皂苷对不同时间段脑出血模型大鼠脑损伤的保护作用

脑出血 ( intracerebral hemorrhage， ICH) 是一种急症重症，严重威胁人们的健康; 脑出血后血凝块回缩，血脑脊液屏障的破坏，血肿周围缺血，组织炎症反应等因素都可造成脑组织的水肿，从而引起功能障碍 ［1］。竹节参总皂苷 ( total saponins ofpanax japonicus，TSPJ) 具有活血化瘀作用，本实验通过观察 12 h 和 72 h 两个时间段 TSPJ 对脑出血大鼠脑组织超氧化物歧化酶 ( SOD) 活性、丙二醛 ( MDA) 及 IL-6、TNF-α 含量的影响，研究其不同时间段的效果及机理。 1 材料与方法 1． 1 实验动物 健康雄性 SD 大鼠，体质量为 240 ～ 280 g，清洁级，由湖北省动物实验中心提供，合格证号:SCXK( 鄂) 2011 ～ 012; 分组: 大鼠随机分为 4 组，假手术组、模型组、TSPJ 低剂量组 ( 100 mg /kg) 、TSPJ 高剂量组 ( 200 mg /kg) ，每组 12 只，分别观察术后 12、72 h 两个时间点各项指标。TSPJ 组术后 6 h 灌胃给药，假手术组及模型对照组灌胃等量生理盐水，以后 12 h /次 TSPJ 组灌胃给药，而假手术组及模型对照组灌胃等量生理盐水，各组饲养条件相同。 1． 2 药品与仪器 竹节三七样品采自湖北恩施，采用醇提取法，精确称取样品 50 mg，定容于 50 ml 容量瓶，精确吸取样品液 2 ml，置 50 ml 容量瓶中定容，摇匀。由华中科技大学生命科学院天然产物实验室通过标准品检测，TSPJ 净含量为 33． 3%，用前配成悬浊液，置 4℃ 冰箱保存备用。Ⅶ型胶原酶，美国 Sigma 公司产品; 注射用尿激酶 ( 批号 03290，南京南大药业有限责任公司) ，配制成 200 IU / L 的溶液;SOD 试剂盒、MDA 试剂盒 ( 上海恒远生化试剂有限公司) ; IL-6、TNF-α 试剂盒，北京福瑞生物工程有限公司。仪器: 大鼠脑立体定位仪，微量注射仪购于北京智鼠多宝生物科技有限责任公司; 电子天平 ( SAＲTOＲ2US，BP211D) ，德国生产; GF-D200 半自动生化分析仪 ( 山东高密彩虹分析仪器有限公司) ， 8021 离心机 ( 上海手术器械厂) ; 752 分光 光度仪 ( 上海精密仪器仪表有限公司) 。 1． 3 模型制备 参照Ｒosenberg 等 ［2］ 的方法，根据包新民大鼠脑立体定位图谱 ［3］ 确定尾状核的位置: 术前禁食，自由饮水，大鼠经戊 巴 比 ( 0． 1 ml /100 g) 腹腔麻醉俯卧位固定于立体定位仪上，据图谱调整立体定位仪于注射点，头皮正中常规消毒后矢状位切开约 1． 5 cm，暴露前囟点，用骨钻钻颅打孔 ( 直径约 1 mm) ，用微量进样器吸取胶原酶 2 ml，迅速插入已钻好孔内，进针 5 mm，注射时间不少于 15 min，留针 10 min 后缓慢退针，钻孔用骨蜡封闭，局部消毒后，缝合皮肤，假手术组注射 2 ml 的生理盐水，手术过程同出血组。 1． 4 检测方法 1． 4． 1 脑组织含水量测定 分别于术后第 12 h 及第 72 h，过量麻醉大鼠，快速断头取脑组织，用滤纸吸干脑表面液体和血迹，小塑料封口袋密闭全脑，电子天平称湿重，然后放入 80℃ 烤箱中，72 h 后称干重。脑含水量计算公式: ［( 湿重－ 干重) /湿重］× 100%。 1． 4． 2 SOD 活性、MDA 含量测定 各组动物再分两组分别于术后第 12 h 及第 72 h，过量麻醉大鼠，快速断头取脑组织，微冻硬后取出，置薄膜隔开的干冰上，分离出血侧皮质及基底节，4℃ 下用预冷的匀浆介质制备成 10% 的脑匀浆置 3000r /min 离心 15 min 后，取上清液按试剂盒方法操作。SOD 活性测定: 通过黄嘌呤及黄嘌呤氧化酶反应系统产生超氧阴离子自由基，进而氧化羟胺形成亚硝酸盐，在 550nm 处测其吸光度，通过公式计算。MDA 含量的测定: 通过过氧化脂质降解产物中的 MDA 可与硫代巴 比酸缩合，形成红色产物，在 532nm 测吸光度。 1． 4． 3 IL-6、TNF-α 测定 分别于术后第 12 h 及第 72 h 手术，取脑匀浆上清液，按放免试剂盒说明书，加入分离剂后充分混匀，放室温 20 min，离心，吸上清，生化分析仪上测放射性，以 B /T 计算 NSB、SO 结合百分率，以 B /B0 计算标准及待测样品结合百分率，并查出样品值。 1． 5 统计方法 以 SPSS 17． 0 统计分析，数据以珋 x ± s 表示，各组间比较采用 t 检验，P ＜ 0. 05 为差异有统计学意义。 2 结果 2． 1 TSPJ 对脑水肿的影响 从表 1 可见， 12 h 时 TSPJ 组脑出血后的脑组织含水量无明显影响， 72 h 时高剂量组 TSPJ 组脑出血后的脑组织含水量减少，和模型组比较有显著性差异 ( P ＜ 0． 05) 。 2． 2 TSPJ 对大鼠脑组织 SOD 活性、MDA 含量的影响 模型组与假手术组各时间段大鼠脑组织 SOD 活性、MDA 含量差异极显著 ( P ＜ 0． 01 ) ; 与模型组比较，TSPJ 高剂量组 12 h 时 SOD 活性有明显差异 ( P ＜ 0． 05 ) ，MDA 含量无明显差异，72 h 高剂量 TSPJ 组 SOD 活性增高，差异极显著 ( P ＜ 0． 01 ) ，MDA 含量下降，差异性显著 ( P ＜ 0． 05) ，见表 2。 2．3 TSPJ 对大鼠脑组织中 IL-6、TNF-α 含量的影响 与假手术组比较，模型组大鼠 IL-6、TNF-α 水平增高，差异有非常显著性 ( P ＜ 0． 01) ; 与模型组比较，12 h 时低剂量组 IL-6 无明显差异，高剂量组 TNF-α 有差异 ( P ＜ 0． 05) ，72 h 时高剂量 TSPJ 组大鼠 IL-6、TNF-α 水平下降 ( P ＜ 0． 05) ，见表 3。 3 讨论 在脑出血的病理发展过程中，脑组织的继发性损伤是脑出血病情加重、预后不良的主要因素 ［4］。出血性脑损伤的炎性反应，由白细胞粘附血管，血-脑屏障遭破坏，炎性细胞侵入脑实质等组成。脑出血时炎性因子表达增加，增加脑水肿、血管壁通透性、炎细胞浸润。IL-6 介导白细胞与内皮细胞粘附，TNF-α 能促进中性粒细胞浸润并释放蛋白水解酶，与神经元损害密切相关 ［5］。实验中可以看出 TSPJ 组脑出血后的脑组织含水量减少，与模型组有显著性差异 ( P ＜ 0． 05) ; 并且 72 h 时 TSPJ 组大鼠脑组织丙二醛含量降低 ( P ＜0． 05) ，超氧化物歧化酶的活力增高，高剂量 TSPJ 组极明显 ( P ＜ 0． 01) ， 72 h 时高剂量 TSPJ 组 IL-6、TNF-α 水平明显下降，与模型组有显著性差异 ( P＜ 0． 05) ，推测脑出血 12 h 内，血肿中的红细胞破裂或被吞噬细胞吞噬，含铁血黄素游离，炎细胞浸润，炎症反应较明显，脑出血第 72 h 血肿经循环吸收清除，炎性细胞数量逐渐减少，炎症因子减少，所以此时血肿变小，炎症反应减轻，超氧化物歧化酶的活力增高，丙二醛降低， IL-6、TNF-α 水平明显下降。因而 72 h 时效果明显除与药物作用有关外，还与疾病不同发展阶段有关，所以药物治疗和研究还要考虑不同时间段病变区别及对药效的影响。总而言之，TSPJ 能在一定程度上减少损伤时自由基生成，抑制脂质过氧化反应，增加体内自由基清除剂如超氧化物歧化酶，减少炎症因子，从而对颅脑损伤有一定保护作用。