环糊精固体包合物的制备和性质（一）

光甘草定是光果甘草特有的疏水性异黄酮类化合物，含量为0.1%～0.3%，具有抗色素异常沉积、抗氧化、抗细胞增殖、抗炎、增强记忆力、抗骨质疏松和抗菌等多种生物活性。GLD难溶于水（7 μg/mL，25 ℃），导致其在体内胃肠道中的溶出率低、吸收和生物利用率差，在水溶性基质的食品和药品等相关领域的应用也因此受到极大的限制。因此，提高GLD在水中的溶解度是开发其潜在应用价值的关键所在。

环糊精是直链淀粉在由芽孢杆菌产生的葡萄糖基转移酶作用下生成的一系列环状碳水化合物的总称，最常见的是α-、β-、γ-CD，分别由6～8 个葡萄糖单元通过α-1,4-糖苷键连接而成。CD各葡萄糖单元的2、3、6位羟基由不同的官能团取代，可得到一系列衍生物，如6-羟丙基-β-环糊精（、2,6-二甲基-β-环糊精和2-磺丁基-β-环糊精等。CD及其衍生物均具有一个由亲水的外表面和相对疏水的中心空腔构成的圆筒式结构，这种独特的结构特性使CD能够通过非共价力（范德华力、静电相互作用和氢键）与多种化合物尤其是疏水性化合物相互作用，将后者包合在空腔中，形成主-客体包合物，从而提高难溶性化合物的溶解度，进而提高在体内的吸收及生物利用率。空腔大小和取代基的种类是影响CD及其衍生物对客体包合能力的重要因素。

本研究通过分子对接和相溶解度结合的方法筛选出适宜包合GLD的CD，并进行固体包合物的制备；考察不同干燥方法、不同投料比对固体包合物的包合率、载药量和溶解度的影响；采用扫描电子显微镜法、差示扫描量热法、傅里叶变换红外光谱法和分子对接技术对固体包合物的形貌、GLD的存在形式、GLD与2-SBE-β-CD的相互作用和空间构象等结构表征进行分析；并在此基础上进一步研究GLD/2-SBE-β-CD固体包合物的体外溶出特性及GLD/2-SBE-β-CD固体包合物对HepG-2细胞增殖的抑制作用。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

GLD 泌阳草木青生物科技有限公司；2-SBE-β-CD、6-HP-β-CD 湖北恒硕化工有限公司；α-CD、β-CD、γ-CD、2,6-M-β-CD、噻唑蓝（methylthiazolyl tetrazolium，MTT） 上海源叶生物科技有限公司；无水乙醇、乙腈、石油醚、二甲基亚砜（dimethyl sulfoxide，DMSO） 天津市德恩化学试剂有限公司；溴化钾 天津市科密欧化学试剂有限公司；铝坩埚上海菁仪化工材料有限公司；DMEM培养基 美国Fetal Bovine Serum生物科技有限公司；胎牛血清 江苏恩莫阿赛科技有限公司；胰消化酶 合肥Biosharp科技有限公司；HepG-2细胞 ATCC细胞库。

1.2 仪器与设备

SCIENTZ-10N冷冻干燥机 宁波新芝生物科技股份有限公司；pHS-3C pH计、L5S紫外分光光度计上海仪电科学仪器股份有限公司；TENSPOR27 FTIR仪德国Bruker仪器公司；DSC1型DSC仪 瑞士Mettler-Toledo公司；6000Y型喷雾干燥机 上海Bilon仪器有限公司；TM3030 SEM 日本日立高新技术公司；E191IR恒温培养箱 美国西蒙公司；CKX41SF倒置电子显微镜 日本Olympus公司；SW-CJ-2FD双人单面超净工作台 苏州净化设备有限公司；RS-232C酶标仪 美国Bio-Rad公司。

1.3 方法

1.3.1 CD的筛选

通过分子对接技术和相溶解度法测定不同种类CD与GLD的包合能力及稳定性，筛选适宜包合GLD的CD。

1.3.1.1 分子对接法

从PubChem数据库下载GLD的3D模型（CID编号为124052），用Gaussian 09软件中的DFT方法（B3LYP/6-31G）对3D模型进行优化。α-CD、β-CD和γ-CD的3D模型从剑桥晶体数据库得到，编号分别为1106001、1107194和1529141。用Gauss View 5.0软件打开去水后的β-CD模型，用相应的取代基将葡萄糖单元中对应2,3,6位取代，得到β-CD衍生物模型；其中，2,6-M-β-CD、单-6-氨基-β-CD、三乙酰基-β-CD的取代度分别为14、1、21，其他β-CD衍生物取代度均为7；用Gaussian 09软件半经验算法中的PM6基组对β-CD衍生物模型的几何构型进行优化。

采用AutoDockTools 4.2软件处理受体（α-CD、β-CD、γ-CD及β-CD衍生物（6-HP-β-CD、2,6-M-β-CD、2-SBE-β-CD、6-硫酸盐-β-CD、单-6-氨基-β-CD、6-羧甲基-β-CD、三乙酰基-β-CD、6-季铵-β-CD））与配体（GLD），添加H原子与原子电荷，并设置GLD分子内可旋转单键数量及根原子。将设置好的受体和配体保存为pdbqt格式。在分子对接过程中，均以受体几何中心为中心，建立尺寸为60 Å×60 Å×60 Å的反应约束盒子。搜索参数选用拉马克遗传算法，算法对接的轮数设为100，能量评估的最大数目设为250 000，其他参数取默认值。对接方法采用半柔性对接。

1.3.1.2 相溶解度法

根据1.3.1.1节计算机模拟得到的结果选择恰当的β-CD衍生物用于本实验。准确称取适量α-CD、β-CD、γ-CD及β-CD衍生物，用去离子水配制浓度分别为0、10、20、30、40、50 mmol/L的CD溶液；其中，β-CD和α-CD溶解度较小，配制其溶液浓度为0、2、4、6、8、10 mmol/L。向上述不同浓度的CD溶液中加入过量的GLD，置于恒温振荡器中，25 ℃、200 r/min避光条件下孵育24 h。取出样品溶液，5 000 r/min离心5 min，取上清液。用80%乙醇溶液（V/V）适当稀释，在281 nm波长处测其吸光度，计算GLD的浓度。以CD浓度为横坐标，GLD浓度为纵坐标，绘制相溶解度图。

1.3.2 GLD/CD固体包合物的干法制备

采用捏合法制备固体包合物。将GLD与筛选出最适宜的CD按物质的量比1∶1称量。用2 倍CD质量的去离子水溶解CD，研磨均匀。用无水乙醇溶液溶解GLD，配制成30 mg/mL的GLD乙醇溶液。将GLD乙醇溶液全部滴加到CD溶液中，研磨45 min，60 ℃烘箱中干燥至质量恒定，得到固体包合物。

1.3.3 GLD/CD固体包合物的湿法制备

将GLD与筛选出最适宜的CD按的物质的量比1∶1称量。用去离子水溶解CD，配制成0.04 mol/L的CD溶液。用少量无水乙醇溶解GLD，配制成30 mg/mL的GLD乙醇溶液。将GLD乙醇溶液加入到CD溶液中，使体系中乙醇体积分数为30%，于25 ℃、200 r/min的条件下振荡24 h。分别将所得溶液用冷冻干燥法、喷雾干燥法和共蒸发干燥法进行干燥，制备固体包合物。

将GLD与CD按物质的量比1∶1.5和1.5∶1称量，重复上述操作，经冷冻干燥后，得到不同投料比的固体包合物。

1.3.3.1 冷冻干燥法

用45 ℃的旋转蒸发器除去所得溶液中的乙醇，将溶液置于－20 ℃冰箱中预冻12 h。置于冷冻干燥机中冻干后，过80 目筛。

1.3.3.2 喷雾干燥法

用45 ℃的旋转蒸发器除去所得溶液中的乙醇。将溶液置于喷雾干燥器中干燥，采用1 mm的加压雾化器，进样速度2.3 mL/min，进风温度180 ℃，排风温度110 ℃，雾化气流速度3.9 m3/min。

1.3.3.3 共蒸发干燥法

将所得溶液置于60 ℃的旋转蒸发器中旋转蒸发至干。

1.3.4 GLD/CD固体包合物饱和溶解度的测定

分别在1 mL去离子水中加入过量的经不同制备方法得到的GLD/CD固体包合物，在室温条件下超声溶解至平衡状态。0.45 μm滤膜过滤，用80%乙醇溶液逐步稀释滤液到合适浓度（稀释10 000 倍）。在281 nm波长处测定吸光度，计算GLD的含量，即为饱和溶解度。

1.3.5 GLD/CD固体包合物包合率和载药量的测定

分别称取两份10 mg经不同制备方法得到和不同投料比的GLD/CD固体包合物。一份溶于1 mL去离子水中，加入9 mL乙腈25 ℃超声处理20 min。5 000 r/min离心5 min后，收集上清液，用乙腈稀释10 倍。测定其在281 nm波长处的吸光度，根据标准曲线计算GLD的质量，即为包合物样品中GLD总质量。

另一份加入400 μL石油醚，充分混匀。5 000 r/min离心5 min，去上清液（用来洗去未被包合的GLD），重复洗2 次，置于烘箱中使石油醚挥发。按上述包合物样品中GLD总质量的测定步骤测定此样品中的GLD质量，即被包合的GLD质量。

1.3.6 GLD/CD固体包合物及相关样品的结构表征

1.3.6.1 SEM分析

对GLD、CD、GLD/CD物理混合物（以质量比1∶100混合均匀）及经不同制备方法得到的GLD/CD固体包合物进行扫描电子显微镜测试。用导电双面胶将样品固定在样品台上，喷镀铂金后在3 kW条件下，分别于300、400、1 200 倍观察样品的表面形态。

1.3.6.2 DSC分析

分别称取GLD、CD、GLD/CD物理混合物及经不同制备方法得到的GLD/CD固体包合物各5 mg，温度扫描范围25～300 ℃，升温速率10 ℃/min，氮气流量10 mL/min，以空盘作为参比，记录各样品的DSC图线。

1.3.6.3 FTIR分析

分别称取适量的GLD、CD、经不同制备方法得到的GLD/CD固体包合物和GLD/CD物理混合物，分别与溴化钾粉末混合，放入研钵内充分研磨，再采用压片法制得样品薄片。将样品薄片放入仪器内进行光谱扫描，扫描范围4 000～400 cm－1，分辨率4 cm－1，扫描次数32 次。以纯溴化钾粉末作背景进行单通道扫描。

1.3.6.4 分子对接法

采用1.3.1.1节的步骤，运用AutoDockTools 4.2软件对GLD与筛选出最适宜的CD包合模式进行模拟得到主客体间的构象及氢键相互作用。

1.3.7 GLD/CD固体包合物在模拟胃肠液中累积溶出率测定

按照Maltais等所述方法配制不含消化酶的模拟胃、肠液。准确称取2.0 g NaCl置于烧杯中，加入100 mL去离子水，用12.0 mol/L浓盐酸调节pH值至1.2，即为模拟胃液。准确称取6.8 g KH2PO4，溶于250 mL去离子水中，用0.2 mol/L NaOH溶液调节pH值至6.9，即为模拟肠液。分别量取900 mL模拟胃液和肠液作为溶出介质，放入1 000 mL烧杯中，置于水浴加热磁力搅拌器，温度保持在（37±0.5) ℃，转速50 r/min。分别准确称取一定质量的GLD、GLD/CD物理混合物及经不同制备方法得到的GLD/CD固体包合物样品（样品中GLD质量均为100 mg），放入烧杯中，并立即开始计时。于2、4、6、8、10、15、20、30、45、60 min时吸取溶出液1 mL，同时补充等体积新鲜的溶出介质。用0.45 μm微孔滤膜过滤溶出液，取滤液0.5 mL，加入4.5 mL乙腈，充分混匀。5 000 r/min离心5 min后，取上清液。

相关链接：光甘草定，环糊精，葡萄糖，抗色素，二甲基亚砜，溴化钾，噻唑蓝，无水乙醇，北纳生物

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