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香豆素类荧光衍生试剂的合成(二)

发布时间:2022-11-21 16:18 作者:北纳生物编辑-陈丹

2 结果与分析

2.1 香豆素类荧光衍生试剂的合成与结构表征

以4-(二乙氨基)水杨醛为先导物,在哌啶催化下与丙二酸二乙酯缩合成环,再经酯水解得到香豆素类荧光衍生试剂L1。采用1H NMR、13C NMR和HRMS波谱技术对荧光衍生试剂L1及中间体化合物1-1进行结构鉴定与表征,结果如下:

中间体化合物1-1:7-(二乙氨基)-2-氧-2 H-色酮-3-羧酸乙酯,红褐色固体,产率75.8%。1H NMR(500 MHz,DMSO)δ 8.54(s,1H),7.62(d,J=9.0 Hz,1H),6.76(dd,J=9.0,2.4 Hz,1H),6.53(d,J=2.3 Hz,1H),4.24(q,J=7.1 Hz,2H),3.48(q,J=7.0 Hz,4H),1.29(t,J=7.1 Hz,3H),1.14(t,J=7.0 Hz,6H)。HRMS(ESI)m/z [M+H]+:C16H19NO4,理论计算值289.131 4,实际检测值290.136 9。

荧光衍生试剂L1:7-(二乙氨基)-2-氧-2H-色酮-3-羧酸,橙黄色固体,产率97.2%。1H NMR(500 MHz,DMSO)δ 12.55(bs,1H),8.59(s,1H),7.68~7.61(m,1H),6.80(dd,J=9.0,2.4 Hz,1H),6.57(d,J=2.3 Hz,1H),3.49(q,J=7.0 Hz,4H),1.14(t,J=7.0 Hz,6H)。13C NMR(126 MHz,DMSO)δ 164.45、159.57、157.84、152.86、149.37、131.79、110.01、107.35、107.12、95.88、44.36、12.27。HRMS(ESI)m/z [M+H]+:C14H15NO4,理论计算值261.100 1,实际检测值261.099 3。

2.2 SF1的分离纯化与结构表征

选用EDC/DMAP为催化缩合剂,二氯甲烷为反应溶剂,氟虫腈与荧光衍生试剂L1用量比为1∶11,在45 ℃水浴中反应60 min,制得衍生化反应产物SF1。利用硅胶柱层析法,对所制备的SF1进行分离和纯化,并通过1H NMR、13C NMR和HRMS波谱技术对其进行了结构鉴定与表征,结果如下:

柱前荧光衍生化产物SF1:N-(3-氰基-1-(2,6-二氯-4-(三氟甲基)苯基)-4-((三氟甲基)亚磺酰基)-1H-吡唑-5-基)-7-(二乙氨基)-2-氧-2H-色酮-3-甲酰胺,黄绿色固体,产率81.5%。1H NMR(400 MHz,DMSO)δ 11.69(s,1 H ),8.79(s,1 H ),8.46(d d,J=17.0,1.3 Hz,2H),7.73(d,J=9.2 Hz,1H),6.87(dd,J=9.2,2.3 Hz,1H),6.61(d,J=2.1 Hz,1H),3.50(q,J=7.0 Hz,4H),1.13(t,J=7.0 Hz,6H)。13C NMR(101 MHz,DMSO)δ 162.92、160.03、157.85、153.99、149.77、139.10、135.24、135.15、133.46、132.75、127.33、126.07、123.39、120.66、111.23、110.93、108.28、104.33、95.98、44.64、12.26。

2.3 荧光衍生试剂L1和衍生产物SF1的荧光光谱特性

由图3可知,荧光衍生试剂L1和氟虫腈荧光衍生产物SF1的荧光光谱性质差别不太大,SF1的激发光波长和发射光波长分别为454 nm和490 nm,Stokes位移为36 nm;L1的激发光波长和发射光波长分别为454 nm和480 nm,Stokes位移为26 nm。从峰形看,L1更加对称、平滑,其峰形比SF1稍好一些;从荧光强度看,在相同浓度下的L1和SF1都具有较强的荧光强度;从Stokes位移看,衍生化反应产物SF1比L1要大10 nm。根据宋昊翰的研究,Stokes位移越大,荧光检测时激发光对发射光的干扰就越小,因此检测会更加稳定些。上述结果显示,氟虫腈通过衍生化反应后所形成的产物,具有良好的荧光光谱性质,使建立高灵敏度的氟虫腈残留检测方法成为可能。


图3 荧光衍生试剂L1(A)和氟虫腈衍生产物SF1(B)在ACN中的荧光光谱扫描图

2.4 氟虫腈柱前衍生化反应条件的优化

2.4.1 催化剂对衍生反应效率的影响

根据文献报道,选择EDC/DMAP、DCC/DMAP和PyBOP/TEA三种碱性催化剂进行实验,检测分析其对氟虫腈与荧光衍生试剂L1的衍生化反应效率的影响。如图4所示,在EDC/DMAP的催化作用下,衍生产物SF1的HPLC-FLD检测所得峰面积极显著高于DCC/DMAP和PyBOP/TEA(P<0.01),因此EDC/DMAP为衍生化反应的优选催化剂。王梦等的研究表明,EDC/DMAP在氟虫腈亚砜酰胺化反应中为较优催化剂。


图4 催化剂对香豆素类荧光衍生试剂与氟虫腈衍生化反应效率的影响

不同大写字母表示差异极显著(P<0.01),不同小写字母表示差异显著(P<0.05)。图5同。

2.4.2 反应溶剂对衍生反应效率的影响

对衍生化反应所使用的溶剂进行优选,选择DCM、ACN、THF、DMF和DMSO 5种常用的衍生化反应溶剂进行试验,分析其对衍生反应效率的影响,结果如图5所示。衍生化反应在DCM中的效率最高,检测到衍生产物SF1的峰面积最大,荧光衍生化反应最完全,其次是在ACN中,而在THF、DMF和DMSO中反应不完全,效率很低。衍生化反应之所以在DCM中反应效率高,主要是因为荧光衍生试剂L1和氟虫腈在DCM中都具有很好的溶解性。基于上述试验结果,优选DCM为衍生化反应的溶剂。


图5 反应溶剂对香豆素类荧光衍生试剂与氟虫腈衍生化反应效率的影响

A.5 种反应溶剂中的衍生反应效率;B.5 种反应溶剂中衍生产物HPLC-FLD检测色谱图。

2.4.3 反应时间对衍生反应效率的影响

在10~80 min时间范围内,衍生化产物SF1的峰面积随反应时间的延长而增大,60 min时达到了峰值;进一步延长反应时间,产物的峰面积不再增加,基本保持不变。上述结果说明,60 min时衍生化反应基本完成,因此优选60 min为衍生化反应时间。

2.4.4 衍生温度对衍生反应效率的影响

温度是最重要的反应条件之一,直接影响衍生化反应的速率和效率,同时也对荧光衍生试剂和衍生产物的稳定性有一定的影响。为了获得适合的衍生化反应温度,设定反应时间为60 min,在5~65 ℃范围内对温度进行考察。在0~45 ℃温度区域内,衍生产物SF1的峰面积随温度的升高而增大;当衍生温度超过45 ℃时,温度升高会导致衍生效率降低,这可能是荧光衍生试剂和衍生产物在高于45 ℃的反应体系中稳定性下降所致。王梦等报道了类似研究结果,45 ℃ 为比较合适的衍生化反应温度。以上结果表明,45 ℃时衍生效率达到峰值,因此45 ℃为优选衍生化反应温度。

2.4.5 衍生试剂用量对衍生反应效率的影响

为了保证荧光衍生化的效率,确保氟虫腈能够反应完全,需要使用适量的荧光衍生试剂,因此本研究对荧光衍生试剂与氟虫腈用量比进行优化。随着荧光衍生试剂L1用量的增加,衍生产物SF1的峰面积不断增大,在用量比达到11∶1时,反应产物不增加,维持在平衡、稳定的状态。因此,优选的用量比(荧光衍生试剂∶氟虫腈)为11∶1。

综上所述,氟虫腈衍生化反应的优选条件如下:EDC/DMAP为催化剂,二氯甲烷为最佳反应溶剂,反应时间和衍生温度分别为60 min、45 ℃,荧光衍生试剂用量比为11∶1。

2.5 基于L1建立的氟虫腈柱前衍生HPLC-FLD检测回归方程和检出限

在前述衍生化试剂合成和衍生化反应条件优化的基础上,建立基于L1的氟虫腈柱前衍生HPLC-FLD检测方法,所得线性回归方程和检出限如表1所示。

表1 基于L1建立的氟虫腈柱前衍生HPLC-FLD检测方法参数

由表1可知,检测回归方程具有较好的线性相关性,R2为0.999 6,检出限和定量限分别达到了0.01 µg/L和0.036 µg/L,在氟虫腈的痕量和微量检测中具有较好的应用前景。

2.6 基于L1建立的氟虫腈柱前衍生HPLC-FLD检测方法评价

对基于L1建立的氟虫腈柱前衍生HPLC-FLD检测方法的精密度、稳定性以及重复性进行评价。该方法的精密度、稳定性以及重复性3 个指标的保留时间的RSD均低于0.4%,峰面积的RSD均低于2.2%。上述结果表明,本实验所建立的氟虫腈HPLCFLD检测方法具有较好的稳定性和可靠性,可在实际检测中进行应用。

3 讨论

HPLC-FLD灵敏、稳定、干扰小,因此被广泛应用于痕量和微量检测。由于氟虫腈本身的荧光微弱,不能直接进行荧光检测,因此需要设计合成能对氟虫腈进行衍生化反应的高荧光强度柱前衍生化试剂,从而建立高灵敏度的氟虫腈HPLC-FLD检测方法。从已有文献资料看,目前尚无HPLC-FLD应用于氟虫腈检测方面的报道。目前氟虫腈的检测方法主要有HPLC、HPLCMS/MS、GC以及GC-MS等,但这些方法还存在一些不足。HPLC-MS/MS、GC-MS具有较高的灵敏度,应用范围较广,但检测成本相对较高,需要较为贵重的精密仪器,操作人员技能要求较高;HPLC检测成本低,操作较为简便,但灵敏度不高,难以达到痕量检测的要求。刘炜等建立了土壤中氟虫腈等6 种农药的HPLC-MS/MS检测方法,该方法氟虫腈的定量限为0.01 mg/kg;郭敏等采用GC法测定土壤中氟虫腈及其代谢物残留,结果显示,氟虫腈及其代谢物的最低检测浓度为1 µg/kg。

根据杨子辉等的研究报道,在DCC/DMAP催化下,阿魏酸的羧酸基团与氟虫腈的氨基基团容易发生反应。为了制备建立HPLC-FLD检测方法所需的氟虫腈荧光衍生化产物,根据这一文献,设计以实验室前期合成的香豆素-3-羧酸作为荧光衍生试剂、与氟虫腈进行衍生化反应的研究方案。根据该研究方案,得到衍生化反应产物经二氯甲烷萃取(3×50 mL)后,再以硅胶柱层析法分离目标物,结果发现产物的纯化比较困难,耗时久,产率较低,明显低于上述文献报道的76.2%;同时反应后体系中极性相近的杂质较多,对后续色谱分离检测会产生干扰。因此,放弃以该化合物为荧光衍生试剂的研究方案,重新设计了以4-(二乙氨基)水杨醛为原料合成了荧光衍生试剂L1的方案。

4 结论

以4-(二乙氨基)水杨醛为原料,经缩合成环、水解等反应合成了一种结构新颖的香豆素类荧光衍生试剂L1,基于L1建立氟虫腈柱前衍生化反应体系,分离、纯化、鉴定了衍生产物SF1;优化后的柱前衍生条件如下:催化缩合剂为EDC/DMAP,反应溶剂为二氯甲烷,荧光衍生试剂L1与氟虫腈用量比为11∶1,反应时间和衍生温度分别为60 min和45 ℃;在此基础上,建立氟虫腈柱前衍生化HPLC-FLD检测方法,该方法的检出限达到了0.01 µg/L,定量限为0.036 µg/L。此外,建立的基于羧基和氨基的柱前衍生化反应方法,还可用于其他具有氨基基团的待测物的检测。综上所述,氟虫腈柱前衍生化HPLC-FLD检测方法具有较好的应用前景,研究思路和方案对HPLCFLD方法研究具有一定的指导意义。

相关链接:阿魏酸氟虫腈二氯甲烷农药水杨醛氨基酸丙二酸二乙酯北纳生物

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