普洱熟茶对D-半乳糖致衰老小鼠的抗衰老作用

近日，云南农业大学食品科学技术学院以D-gal皮下注射建立小鼠衰老模型，利用超高效液相色谱-四极杆静电场轨道阱质谱（UPLC-QE-MS）代谢组学技术，并采用偏最小二乘判别分析（PLSDA）、正交偏最小二乘判别分析（OPLS-DA）方法结合变量投影重要度（VIP）与非参数检验共同分析对照组、D-gal衰老模型组、普洱熟茶组小鼠脑组织和血清中代谢物的变化规律，通过总体（脑组织）及外周（血清）代谢组学探寻普洱熟茶延缓衰老的潜在代谢物，揭示与普洱熟茶抗衰老作用机制有关的代谢通路，以期为普洱熟茶的作用机制研究提供新的思路。

普洱熟茶是一种以云南大叶种晒青毛茶经微生物发酵加工而成的后发酵茶，可作为一种长期饮用的饮品。本课题组前期研究发现，普洱熟茶可以有效提高D-半乳糖（D-gal）致衰老小鼠肝脏中超氧化物歧化酶及谷胱甘肽过氧化物酶的活性，降低丙二醛含量，表明普洱熟茶能够对抗自由基损害，有效预防由氧化应激导致的氧化损伤，具有强抗氧化能力，从而延缓衰老。

1 普洱熟茶对衰老小鼠学习记忆能力的影响

由实验结果可知，在5 d定位航行实验中，随着训练时间的延长，各组小鼠逃避潜伏期均缩短。与第1天相比，第5天对照组、D-gal模型组、普洱熟茶组小鼠逃避潜伏期分别缩短58.42%、50.54%、32.57%。

由实验可知，在第6天空间探索实验中，与对照组相比，D-gal模型组小鼠到达平台时间显著延长（P＜0.05）；与D-gal模型组相比，普洱熟茶组小鼠到达平台时间显著缩短18.12%（P＜0.05）。结果表明机体的衰老会引起小鼠学习记忆能力衰退，给予普洱熟茶能够提高衰老小鼠的学习记忆能力。

2 普洱熟茶对衰老小鼠脑组织代谢物变化的影响

采用PLS-DA法将经过预处理的3 组小鼠样本的UPLC-QE-MS脑组织代谢物数据进行整体分析，结果表明3 组样本能够被明显区分，说明注射D-gal的衰老小鼠和给予普洱熟茶的衰老小鼠脑内代谢物发生显著变化。为了进一步验证3 组样本的分离，并筛选关键代谢物，进行OPLS-DA分析，结果表明对照组和D-gal模型组、D-gal模型组和普洱熟茶组样本显著分离，数据模型有较好的拟合度及预测能力。其中对照组和D-gal模型组RX2＝0.679，RY2＝0.992，Q2＝0.829；D-gal模型组和普洱熟茶组RX2＝0.631，RY2＝0.968，Q2＝0.681。通过置换检验进行模型验证，200 次置换检验后对照组和D-gal模型组的截距R2＝0.826，Q2＝－0.597，D-gal模型组和普洱熟茶组的截距R2＝0.924，Q2＝－0.340，表明模型有较好的预测能力与可靠性。

为了进一步分析普洱熟茶延缓小鼠衰老的相关差异代谢物，根据VIP＞1、P＜0.05的标准，通过KEGG在线数据库筛选鉴定出26 种差异代谢物，主要分为甘油磷脂类、氨基酸、有机酸、脂肪酰类、核苷等。与D-gal模型组相比，普洱熟茶组中18 种代谢物表达上调，8 种代谢物表达下调。

3 普洱熟茶对衰老小鼠血清代谢物变化的影响

采用PLS-DA法将经过预处理的3 组小鼠样本的UPLC-QE-MS血清代谢物数据进行整体分析，结果表明3 组样本能够被明显区分，说明注射D-gal的衰老小鼠和给予普洱熟茶的衰老小鼠血清代谢物发生显著变化。为了进一步验证3 组样本的分离情况，并筛选关键代谢物，进行了OPLS-DA分析，结果表明对照组和D-gal模型组、D-gal模型组和普洱熟茶组样本显著分离，数据模型有较好的拟合度及预测能力。其中对照组和D-gal模型组：RX2＝0.650，RY2＝0.901，Q2＝0.220；D-gal模型组和普洱熟茶组：RX2＝0.583，RY2＝0.980，Q2＝0.735。通过置换检验进行模型验证，200 次置换检验后对照组和D-gal模型组的截距R2＝0.897，Q2＝－0.370，D-gal模型组和普洱熟茶组的截距R2＝0.881，Q2＝－0.568，表明模型有较好的预测能力与可靠性。

为了进一步分析普洱熟茶延缓小鼠衰老的相关差异代谢物，根据VIP＞1、P＜0.05的标准，通过KEGG在线数据库筛选鉴定出11 种差异代谢物，主要分氨基酸、有机杂环化合物、脂肪酸类、植物激素等。与D-gal模型组相比，普洱熟茶组中6 种代谢物表达上调，5 种代谢物表达下调。

4 差异代谢物的聚类分析

筛选得到的差异代谢物通过层次聚类分析能够更直观地显示样本之间的关系以及代谢物在不同样本中表达模式上的差异。根据上方样本聚类的树状图，小鼠脑组织样本可分成两个区域，D-gal模型组的6 个平行样本为第一区域，普洱熟茶组和对照组为第二区域，D-gal模型组的代谢物颜色比其他两组深；第二区域两组样本分支离得越近，说明这两个样本所有代谢物的表达量变化趋势越接近。小鼠血清样本中代谢物能够明显区分为D-gal模型组和其他两组，但普洱熟茶组和对照组样本代谢物的表达模式极接近，未完全区分。硫酸胆固醇能够通过减少氧化应激来调节脑代谢。本研究结果显示，与对照组相比，D-gal模型组小鼠脑内硫酸胆固醇、二磷酸腺苷核糖等代谢物表达明显下调，表明小鼠处于氧化损伤状态。

肌肽已被证明具有神经保护作用，其可穿透血脑屏障，降低与多种病理状况有关的氧化应激。脂类物质与体内自由基的产生、氧化应激、老化速度等密切相关。本研究结果表明，给予普洱熟茶干预后，组氨酸代谢通路相关代谢物肌肽以及PC（15:0/15:0）、PE（22:2/14:0）等甘油磷脂代谢通路相关代谢物表达明显升高，提高了衰老小鼠的抗氧化应激能力。D-gal模型组小鼠体内前列腺素D2、5’-磷酸吡哆醛代谢物表达明显下调，给予普洱熟茶干预后其表达明显上调，表明花生四烯酸代谢通路和VB6代谢通路被显著激活。

5 差异代谢物的代谢通路分析

本研究结果表明普洱熟茶的干预可显著改善小鼠学习记忆减退。本研究基于UPLC-QE-MS代谢组学方法，并结合多元统计学分析研究D-gal致衰老小鼠在普洱熟茶干预下的脑组织和血清代谢变化，鉴定分析出37 种差异代谢产物。通过差异代谢物和代谢通路相关性分析，筛选出4 条脑组织代谢通路，甘油磷脂代谢和组氨酸代谢通路为最显著的关键代谢通路，映射出肌肽、PC（20:5/20:4）、PC（22:5/P-18:1）、PS（20:5/18:1）等10 个关键代谢物；筛选出2 条血清代谢通路，VB6代谢通路为最显著的关键代谢通路，映射出前列腺素D2和5’-磷酸吡哆醛2 个关键代谢物。这些代谢物可能为延缓衰老的潜在生物标志物。

未来可进行代谢物在体验证，进一步解析其在延缓衰老过程中的重要作用。将筛选出的差异代谢物进行通路富集分析，小鼠脑组织中筛选到甘油磷脂代谢、VB6代谢、组氨酸代谢和嘌呤代谢通路，其中甘油磷脂代谢和组氨酸代谢通路最为显著。小鼠血清中筛选到VB6代谢和花生四烯酸代谢通路，其中VB6代谢通路最为显著。为了更直观地了解代谢通路映射出的12 个关键代谢物，采用箱形图比较3 组间这12 种物质的含量丰度差异。结果显示普洱熟茶能够延缓小鼠衰老，与D-gal组相比，其脑组织中伴随着组氨酸代谢通路相关代谢物肌肽，VB6代谢通路相关代谢物吡哆醛，甘油磷脂代谢通路相关代谢物PC（20:5/20:4）、PC（22:5/P-18:1）、LysoPC（P-18:1）、PE（22:2/14:0）、LysoPC（18:2）、PS（20:5/18:1）、PC（15:0/15:0）以及嘌呤代谢通路相关代谢物二磷酸腺苷核糖表达量的显著上调；血清中伴随着花生四烯酸代谢通路相关代谢物前列腺素D2以及VB6代谢通路相关代谢物5’-磷酸吡哆醛表达量的显著上调。

相关链接：D-半乳糖，丙二醛，谷胱甘肽，氨基酸，有机酸，胆固醇，北纳生物

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