基于六偏磷酸钠复合水凝胶包埋体系的构建及作用机理

植物乳杆菌（Lactobacillus plantarum）可以平衡肠道微生物菌群，提高免疫功能，但由于植物乳杆菌在食品制造、运输、储存及人体胃肠道消化过程中会遇到环境压力，如高温、盐、氧气及胃液和胆盐等因素的影响，从而降低生物利用度，限制其功能特性的发挥。水凝胶是由一种或多种天然或合成聚合物组成，能够保护益生菌免受其在食品加工过程中恶劣条件的影响，同时凝胶基质可以抵抗载体在胃肠道发生化学和酶降解，并有效地在结肠中释放其负载的生物成分，是目前研究中发现的一项较好的益生菌保护机制。明胶（GE）是由胶原蛋白部分水解而来，是一种常用的蛋白质类水凝胶。

因此，河南科技大学食品与生物工程学院研究团队通过六偏磷酸钠（SHMP）对GE进行修饰构建初级网络水凝胶，加入植物乳杆菌后利用谷氨酰胺转氨酶（TGase）进一步修饰GE/SHMP，使其更有利于植物乳杆菌递送，以GE、GE/SHMP水凝胶及包埋体作为对照，利用物理和化学分析方法对水凝胶复合体系的结构及性能进行分析，探讨GE/SHMP/TGase的作用机理及包埋植物乳杆菌后对水凝胶性能的影响，以期为益生菌功能性食品的开发及贮藏提供理论依据。

1 处理方式对复合水凝胶包埋体凝胶强度影响

通常情况下，凝胶强度受氨基酸含量、分子质量分布和提取过程的影响。SHMP和TGase修饰的GE复合体的强度高于单一经SHMP修饰的GE，说明经TGase修饰后能显著增加GE的凝胶强度。虽然向体系中加入植物乳杆菌后可能会干扰凝胶基质中GE/SHMP或TGase分子的相互作用，导致凝胶网络不均匀，水凝胶的凝胶强度降低，但结果表明GE/SHMP/TGase复合水凝胶的胶强度显著高于GE/SHMP复合水凝胶及单一的GE水凝胶（P＜0.05），说明GE/SHMP/TGase复合水凝胶包埋体的分子间作用力较强，有利于包埋的植物乳杆菌的抵抗不良环境的影响。

2 复合水凝胶包埋体胶凝动力学分析

在最初0.5 h内所有凝胶体系的G’和损耗模量G”都以较快的速率增长，G’和G”在某一点（即凝胶点）相交后G’变得高于G”，这表明在冷却过程中形成了凝胶胶体。由于凝胶化过程是GE分子从无规卷曲变成三螺旋的过程，胶体网络结构形成后，G’随着时间的推移以较小的速率增加，表明GE及复合物继续形成三螺旋结构，进一步增强凝胶网络结构。对凝胶动力学方程进行分析，可以发现所有复合凝胶体系的G’和G”随着时间的延长凝胶G’在95%的置信区间内具有典型的一致变化。对图2B、D、F分析可知当加入植物乳杆菌后会减少分子之间的物理相互作用或共价交联键的数量，凝胶G’损失，从而影响凝胶网络连接，导致加菌后凝胶形成的速率比未加菌凝胶形成速率低。对比图2A、C、E可知，经改性后复合凝胶形成速率显著低于单一GE的胶凝速率，这是因为TGase催化GE产生空间效应从而形成了含有共价键的聚合物，该络合物限制了GE分子链的灵活性，从而降低了其凝胶化速率。

3 复合水凝胶包埋体水分分布状态分析

经复合水凝胶对应的水的特征是在0.01～1 ms（T21）范围内具有最小的流动性；在1～100 ms（T22）范围内出现了一个很小的弱峰，表示水凝胶网络中的水流动性较差；在100～10000 ms（T23）范围内相应的信号强度远低于游离水，说明游离水位于交联网络之外，具有优异的流动性。而较短的初始弛豫时间T2对应于水与基质之间结合更加紧密，水的流动分数更小，水凝胶样品的自由度和迁移率较低，凝胶网络结构致密，另外从图3可以发现，经SHMP和TGase修饰后水凝胶样品各峰面积所占比例高于GE，这可能是因为磷酸化过程中引入了负电荷，在GE分子链中引入磷酸基团可以增强磷酸基团与GE中氨基酸的NH3+之间的离子相互作用，导致蛋白质的聚集，进一步限制了水分子的流动。表明GE/SHMP/TGase复合水凝胶包埋体相对于单一的GE基水凝胶，体系对水的结合能力得到了极大的改善，能将水分子牢固地保留在凝胶网络中，进而可以提升凝胶的pH值响应能力，调节植物乳杆菌在模拟胃液中的释放行为。

4 复合水凝胶包埋体的稳定性分析

对于GE，Td通常指的是螺旋-螺旋转变温度，Td值主要与GE分子链之间的非共价相互作用和三螺旋样结构的数量有关，它代表三螺旋结构中氢键的断裂和无规则螺旋的形成，反映了GE体系中三螺旋状结构的稳定性。GE/SHMP/TGase复合水凝胶的热变性温度高于GE/SHMP高于GE，说明GE经SHMP及TGase修饰后热变性温度提高，这是因为GE三螺旋和最终网络结构的主要能量来源于GE链之间形成的氢键或疏水相互作用，而这种相互作用是非共价结合，形成的稳定性差、对热敏感，而GE/SHMP是通过离子之间的静电相互作用而交联在一起，因此需要更多的热量才能破坏其稳定性，酶交联后蛋白侧链上特定基团交联形成了更大的分子，产生了大量的高能异肽共价键，从而使产物的热稳定性进一步提高，表明TGase的存在提高了该复合包埋体系的化学稳定性。

5 复合凝胶结构特征分析

5.1 复合凝胶形成过程中三级结构的变化

磷酸化GE的荧光强度高于单一GE，可能是由于磷酸化使GE的芳香基团暴露从而使其三级构象发生改变，蛋白质展开，可以推测磷酸化促使GE的芳香族氨基酸暴露在水中并与蛋白质分子表面的磷酸化基团发生反应。在磷酸化预处理后TGase介导交联，观察到发射波长最大值蓝移（527.01～525.97 nm），表明蛋白质中的氨基酸经过磷酸化预处理后TGase介导交联改变了GE的氨基酸微环境的极性。当植物乳杆菌被添加到凝胶中时，GE分子之间的氢键和静电相互作用减少，从而将疏水基团驱逐到表面，对于单一含有植物乳杆菌的GE，植物乳杆菌的存在导致凝胶的荧光强度降低，并伴有轻微的红移，这表明这些蛋白质将其含色氨酸的延伸区暴露于极性更大的环境（水相），植物乳杆菌产生强烈的空间位阻效应，从而阻断色氨酸残基的荧光信号，并因此导致荧光强度下降。

5.2 复合凝胶形成过程中二级结构的变化

磷酸化GE的FTIR光谱图如图6所示。通常酰胺A与分子内氢键偶合的—NH伸缩振动有关，对于GE酰胺A的吸收峰出现在3420 cm-1附近，GE/SHMP与GE/SHMP/TGase酰胺A的吸收峰分别出现在3408 cm-1和3356 cm-1处，GE/SHMP/TGase有明显的红移，这可能是由于GE中的—COOH、—OH基团和—NH残基之间形成了更多的氢键。在2360 cm-1处发生了明显的变化这是二氧化碳呼吸峰造成。磷酸化GE酰胺I带的变化归因于C＝O伸缩振动，该伸缩振动与CCN变形、CN伸缩和NH平面内弯曲模的贡献相偶合，分别在1666 cm-1（GE/SHMP）和1668 cm-1（GE/SHMP/TGase）附近，而GE的酰胺I带约为1646 cm-1，与未磷酸化GE的结果相比磷酸化后发生明显蓝移，这可能是由于引入磷酸基团产生的静电相互作用。从图6可以看出，GE在1244 cm-1处仅有一个很弱的吸收峰，这表明GE链中引入了磷酸基团，可以推断磷酸化GE中可能形成C—N—P键。在707～1082 cm-1范围内的吸收带对应于C—C和C—O—C骨架的对称伸缩振动，GE在该范围内具有很多较小的弱峰，而GE/SHMP与GE/SHMP/TGase在该处的峰增强，峰位变尖，说明在该处碳链骨架增长，进一步证实了GE/SHMP/TGase水凝胶通过非共价键及共价键结合形成了致密的凝胶网络结构，有利于植物乳杆菌的包埋。

5.3 复合凝胶微观结构分析

所有凝胶样品均呈蜂窝状网络结构，与典型的GE网络结构一致。添加TGase后水凝胶的微观结构更加有序和稳定，水凝胶中出现层状结构和多孔结构的组合，但GE/SHMP/TGase水凝胶的孔径远小于GE/SHMP的水凝胶，使其更适合益生菌的递送系统。嵌入益生菌的水凝胶的微观结构与不含益生菌的水凝胶相似，但前者略显不规则。

5.4 图解模型

建立关于SHMP与TGase增加GE功能特性的模式图。蛋白质的天冬氨酸基（β-羧基）、苏氨酸基、丝氨基和酪氨酸残基上的氧与磷酸基团相连，形成了非共价键，引入的磷酸基团可以与水分子形成大量的氢键，促进了凝胶网络的形，加入植物乳杆菌后，其通过氢键和疏水相互作用嵌入GE/SHMP复合水凝胶中。由于引入的磷酸基团增加了蛋白质体系的电负性，磷酸化预处理后导致GE的分子结构发生变化，暴露出更多的TGase作用位点。TGase靶向交联谷氨酰胺的γ-COOH和赖氨酸的ε-NH2，形成了共价键。TGase的进一步交联导致小分子质量聚合物消失，通过蛋白质分子内部和蛋白质分子之间的共价和非共价交联，增加了大分子质量蛋白质聚合物的形成和含量。

6 植物乳杆菌在模拟胃液肠液中的存活性及释放性分析

所有类型水凝胶包埋的植物乳杆菌细胞活菌数在9.48～9.59（lg（CFU/mL））。经模拟胃液消化后GE/SHMP/TGase、GE/SHMP、GE水凝胶中植物乳杆菌存活率相对于初始活菌数分别为89.5%、62.3%、57.02%。这些结果表明将植物乳杆菌包裹在GE/SHMP/TGase水凝胶中可以最大限度保护植物乳杆菌活菌数免受胃液中不利条件的影响。GE/SHMP/TGase水凝胶中植物乳杆菌活菌数的提高是因为其致密的网状结构可以抑制胃酶渗透到凝胶网络中。此外，由于其具有较高的凝胶强度，分子间的相互作用力强，从而降低胃酸和胃蛋白酶向水凝胶中的扩散速率。水凝胶经模拟肠液处理2 h后，所有类型的水凝胶中植物乳杆菌活细胞数均减少，但其下降速率显著低于在胃液中的活细胞数，说明大多数植物乳杆菌死亡发生在模拟胃液处理期间，这可能是由于植物乳杆菌对胃酸的耐受性相对较低所致。单一GE凝胶网络结构较差对植物乳杆菌的保护性低，导致其在模拟胃液消化后代谢活性降低，经模拟肠液处理后下降了4 个对数周期，而复合水凝胶基质中在模拟肠液中仅下降了1 个对数周期，这可能是复合水凝胶中的凝胶网络可以通过减缓低酸性环境对植物乳杆菌的代谢活性造成影响，从而对其起到一定的保护作用。

不同复合材料的累计释放速率不同，单一GE中植物乳杆菌的释放速率在前30 min内迅速增加，然后在其余时间缓慢增加，之后保持不变，GE/SHMP水凝胶在0～60 min内观察到较低的释放率，在消化60 min后也显示出突然释放，表明凝胶结构的形成能够延缓其在模拟胃液阶段的释放。复合水凝胶的累计释放量为66.2%略高于GE/SHMP（44.6%）和GE（37.0%），在模拟胃液中GE/SHMP/TGase释放速率最慢，而在模拟肠液中的释放速率变快。造成上述差异的原因由很多因素决定，包括活性成分的性质、水凝胶的结构和大小、聚合物的性质以及聚合物基质的相互作用。GE/SHMP/TGase不仅对植物乳杆菌的控释具有协同作用，还有助于增加模拟肠液消化后的累积释放。

7 复合凝胶包埋体贮藏稳定性分析

水凝胶中的植物乳杆菌在4 ℃定期监测28 d期间其稳定性，在贮存期间具GE/SHMP/TGase水凝胶中植物乳杆菌的活菌数没有明显变化，但对于其他水凝胶，植物乳杆菌的存活率趋于降低。这可能是因为GE/SHMP/TGase具有致密的网状结构和厚壁的蜂窝状微观结构而表现出最佳保水能力，有效减少了水凝胶脱水收缩导致的益生菌损失。

8 结论

本研究主要以GE/SHMP/TGase制备复合水凝胶包埋体，以GE、GE/SHMP水凝胶及包埋体作为对照，通过对水凝胶及包埋体的流变特性、凝胶强度、水分迁移状况、热稳定性、微观结构、FTIR光谱及荧光光谱进行测定，研究GE/SHMP/TGase的作用机理及对植物乳杆菌的包埋效果。通过对凝胶体系的流变性能、热稳定性及微观结构进行分析发现GE/SHMP/TGase复合水凝胶的凝胶形成速率较低，酶交联后蛋白侧链特定基团交联形成了更大的分子，产生了大量的高能异肽共价键，导致其热稳定性增加，形成了更加稳定的三维网络结构，有利于植物乳杆菌的长期稳定的存在。低场核磁共振分析表明GE/SHMP/TGase具有更好的保水作用，SHMP和TGase的引入可以改变体系对水的结合能力，促进凝胶形成更加致密的空间网络状结构，进而可以提升壳层凝胶的pH值响应能力，调节包埋物质在SCF中的释放行为。

模拟胃肠道消化实验表明，经模拟胃液和模拟肠液消化后，GE/SHMP/TGase水凝胶包埋的植物乳杆菌的存活率显著高于单一GE基水凝胶。贮藏实验结果表明GE/SHMP/TGase水凝胶包埋的植物乳杆菌的储存稳定性（28 d内）较好。进一步证实该复合水凝胶包埋体具有较高的稳定性、流变特性、保水性及凝胶网络结构特性等性能。因此，利用GE/SHMP/TGase复合水凝胶包埋植物乳杆菌，可以有效提升植物乳杆菌的在胃肠道等不利因素下的存活性，为益生菌产品的开发提供有益参考。

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