靶向Ｇ蛋白偶联受体的肽类药物（二）

发布时间：2021-07-30 17:17 作者：北纳生物编辑-何世琳

3 靶向G蛋白偶联受体的肽类药物及其发现

人体内有多种CPCR的内源性多肽类配体,例如降钙素,催产素、生长抑素、胰高血糖素样肽、加压素、甲状旁腺素和促性腺激素释放激素等,对这些多肽的改造和修饰是多肽药物开发的主要方向之。目前,上市的将近50种靶向GPCR的肽类药物的主要靶点包括胰高血糖素样肽受体、甲状旁腺素受体、生长抑素受体、促性腺激素释放激素受体、加压素/催产素受体和钙敏感受体等,用于治疗代谢性疾病、神经系统疾病和癌症等多种疾病。已上市的多肽药物多是通过化学合成(例如固相多肽合成法) ,或者基因重组技术合成的拥有与内源性多肽配体相似序列的多肽类似物及其衍生物。

下文将重点介绍几类研发成功已上市的靶向GPCR肽类药物(见Table 2 )。

靶向GPCR肽类药物|北纳生物

3.1 靶向胰高血糖素样肽1受体的肽类药物

胰高血糖素样肽-1受体( glucagon-like peptide-1receptor，GLP-1R)主要在胰腺中表达,其激动剂类药物是近年来降糖药物研发的热点。CLP-1R的天然多肽类配体胰高血糖素样肽1(glucagon-like pep-tide-1，GLP-1)是37个氨基酸的肽。摄入葡萄糖后,肠道内分泌L细胞合成并分泌CLP-1 ,作用于CLP-1R,引起细胞内cAMP增加,促进葡萄糖诱导的胰岛素分泌,抑制胰高血糖素的释放。除了其特有的葡萄糖依赖的胰腺作用外,GLP-1还发挥着降低食欲和促进饱腹感的中枢作用,突出了其作为糖尿病或肥胖症疗法的潜。天然GLP-1半衰期短,会被体内二肽基肽酶Ⅳ ( dipeptidyl pepti-dase IV,DPP-Ⅳ)迅速降解并被肾清除,不适合直接作为药物应用。目前,已有7种多肽类GLP-1R激动剂上市,用于治疗2型糖尿病。

3.1.1 Exendin-4及其衍生物

1992年,Eng 等从Gila毒蜥的毒液中分离出一种天然肽Exendin-4,具有与GLP-1相似的药理学特性。例如,可增加胰岛素分泌、降低血糖水平等。与GLP-1不同的是,Exendin-4因其N-端第2位的丙氨酸替换为甘氨酸,不被DPP-IV降解,因此具有更长的半衰期和较强的生物活性。Exenatide(艾塞那肽)即人工合成的Exendin-4,包含39个氨基酸,在2005年获得FDA批准,是第1个用于治疗⒉型糖尿病的GPCR靶向药。Exenatide可以与CLP-1R结合改变其构象,激活AC,使细胞中cAMP增加,从而促进葡萄糖依赖的胰岛素分泌、抑制胰高血糖素分泌和增加胰岛素敏感性,达到降低血糖的目的。

目前, Exenatide有每日2次(Exenatide BID)和每周1次(Exenatide QW)两种剂型。Exenatide BID除可有效降低患者的血糖外,还能发挥降低体重的作用,特别适合作为合并向心性肥胖的2型糖尿病患者的治疗药物。但由于Exenatide BID 需要频繁皮下注射,可能导致患者依从性差。Exenatide QW是首个实现一周1次给药的GLP-1R激动剂,其通过微球技术,使Exenatide在体内缓慢释放,发挥长效降糖作用。继Exenatide QW后,人们也采用了多种其他策略来提高GLP-1R激动剂的血浆稳定性，以延长其半衰期。这些策略可大致分为两种:一种是对Exenatide 的序列进行修饰,延长其血浆半衰期,例如Lixisenatide(利西拉肽) ,省略了肽 Ex-enatide序列中第38位的脯氨酸并在其C-端添加了6个赖氨酸残基和1个酰胺基,这些修饰延长了其血浆半衰期。

3.1.2 胰高血糖素样肽1衍生物

另一种策略则侧重于修饰天然的GLP-1,例如Liraglutide(利拉鲁肽)、Albiglutide(阿必鲁肽)、 Dulaglutide(度拉鲁肽)和Semaglutide(索马鲁肽)。Liraglutide于2010年获得FDA批准,其将天然CLP-1上的第34位赖氨酸替换为精氨酸,并在第26位赖氨酸上增加了1个连接谷氨酸的C16棕榈脂肪酸侧链,从而增加了其与血浆白蛋白的结合,降低了DPP-Ⅳ的酶切作用和肾的清除速率。除以与 Exenatide类似的机制发挥降糖作用外, Liraglutide 与CLP-IR结合后还能延缓胃排空,在治疗肥胖症方面效果显著。Albig-lutide和l Dulaglutide均是以融合蛋白质形式生产出来的,Albiglutide是通过基因重组技术利用酵母产生的,与人血清白蛋白融合,其将天然CLP-1 上第2位的丙氨酸替换为甘氨酸以抵抗DPP-Ⅳ降解:; Dulaglutide是利用哺乳动物细胞培养产生的，共价连接到人IgG4-Fc重链上,这些修饰分别降低了这2种药物肾的清除率,增加了其药理活性的持续时间。

与上述几种GLP-1R 激动剂相比, Semaglutide最主要的突破是实现了CLP-1R激动剂的长效制剂和口服制剂。2017年, Semaglutide注射剂被FDA批准上市,可延长到每周注射1次。其长效机制是基于对结构的化学修饰。在 Semaglutide 中,天然GLP-1的第8、34位氨基酸分别被2-氨基异丁酸(2-aminoisobutyric acid)和精氨酸取代,使其能有效避免被 DPP-IV降解;并且,其中天然CLP-1的第26位赖氨酸被硬脂酸酰化( acylated with stearic diac-id) ,能够使其与人血清白蛋白结合,从而延长血浆半衰期并避免被肾快速清除。这些修饰都延长了多肽在体内循环的时间,使其半衰期可以达到7d之久。Semaglutide口服制剂刚于2019年被FDA批准上市,其利用了Eligen公司研发的基于促吸收剂的大分子递送技术:大分子药物被多个促吸收剂SNAC[ 8-(2-羟基苯甲酰胺基)辛酸钠]分子包裹形成脂质体结构,可保护多肽药物不被胃中的酶类降解。

3.2 靶向胰高血糖素样肽2受体的肽类药物

胰高血糖素样肽2受体( glucagon-like peptide-2receptor ，GLP-2 R)主要分布于胃肠道组织中,通过cAMP依赖性信号转导途径实现对胃肠道的调控，增强肠道营养吸收。GLP-2R的天然肽类配体胰高血糖素样肽2( glucagon-like peptide-2.GLP-2)是由33个氨基酸组成的肠源性多肽,由肠道内分泌L细胞分泌,可被 DPP-IV快速降解,半衰期非常短,仅为7min。 Teduglutide (替度鲁肽)是一种由DNA重组技术合成的GLP-2类似物，2012年被FDA批准为治疗依赖肠外营养支持的成人短肠综合征的孤儿药。短肠综合征( short bowel syndrome , sBS)是一种罕见的具有潜在生命危险的吸收不良疾病,其原因是先天性缺陷.疾病导致的吸收障碍或广泛手术切除导致大部分肠道功能丧失。当SBS患者肠道吸收营养物质、电解质和水的能力不能满足机体需要时,需要肠外营养支持。在Teduglutide 中 ,天然CLP-2的第2位丙氨酸被替换为甘氨酸以抵抗DPP-IV降解、延长血浆半衰期，其可通过作用于GLP-2R来发挥生物学作用,实现对胃肠道的调控,减少胃排空和分泌,并促进小肠粘膜上皮细胞的生长、增殖和修复,从而增加小肠吸收、减少腹泻。

3.3 靶向甲状旁腺素1受体的肽类药物

甲状旁腺素Ⅰ受体( para thyroid hormone 1 re-ceptor ，PTHIR)主要表达于肾和骨骼,存在2种不同的高亲和性构象:G蛋白非依赖构象(RO)和G蛋白依赖构象(RG)。与RO构象亲和力更高的配体主要激活β-抑制蛋白信号通路而引发受体内吞,触发长时程信号反应;与RG构象亲和力更高的配体主要激活G蛋白介导的cAMP依赖性信号转导通路,触发瞬时信号反。甲状旁腺激素( parathy-roid homone，PTH)和甲状旁腺激素相关肽(PTH-related peptide，PTHrP)是骨代谢过程中重要的调节因子,甲状旁腺激素相关肽的N-末端含有甲状旁腺激素同源序列,二者均可作用于PTHIR通过cAMP依赖性的PKA信号转导通路调节骨代谢。不同的是甲状旁腺激素主要调节钙的稳态和骨吸收,而甲状旁腺激素相关肽是促进骨形成的关键肽。

3.3.1 甲状旁腺激素类似物

Teriparatide Teripa-ratide(特立帕肽)是含有34个氨基酸的甲状旁腺激素类似物,也是第1个被FDA批准上市的调节骨代谢的肽类药物,其主要作用于甲状旁腺素Ⅰ受体的RO构象,促进β-抑制蛋白的结合而导致内吞过程，可持续调节cAMP含量,从而持续性激活下游信号通路,介导长时程信号转导,加快骨吸收。

3.3.2 甲状旁腺激素相关肽类似物

AbaloparatideAbaloparatide(阿巴洛肽)是第1个被开发的甲状旁腺激素相关肽类似物,具有34个氨基酸,于2017年被FDA批准用于绝经后女性骨质疏松症的治疗。其主要作用于甲状旁腺素Ⅰ受体的RG构象,引发瞬时的cAMP含量的增高,介导短暂的信号反应,促进骨形成的能力超过骨吸收。这2种药物靶向同一受体甲状旁腺素1受体,但由于其构象偏好性存在差异,它们激活同一靶点的下游信号通路不同,导致Abaloparatide对于绝经后女性骨质疏松症的疗效优于Teriparatidel。这也启示在研发靶向GPCR的肽类药物时应考虑其构象偏好性。

3.4 靶向生长抑素受体的肽类药物

生长抑素受体( somatostatin receptor ，SSTR)家族包括SSTR1-5,广泛分布于中枢神经系统、垂体和许多外周器官。生长抑素受体的天然配体生长抑素( somatostatin，SST)与受体结合可诱导cAMP依赖性信号转导途径,抑制各种促肿瘤生长的激素和生长因子的释放,从而抑制癌细胞增殖或诱导癌细胞凋亡。生长抑素对受体具有很高的亲和力,但在血浆中的半衰期非常短,仅为1~ 3 minl7]。一种人工合成的天然生长抑素的八肽衍生物—-环状生长抑素受体激动剂Octreotide (奥曲肽)可用于治疗神经内分泌肿瘤和肢端肥大症。通过引入D-氨基酸,Octreotide 血浆半衰期可达72~113 min,并可选择性地与生长抑素受体和生长抑素受体5结合。Octreotide与生长抑素受体结合后,通过PLC介导的信号转导通路,产生第二信使IP,并可激活L型Ca*通道,抑制生长激素的产生。Pasireotide(帕瑞肽)是另一种生长抑素受体激动剂,是美国和欧盟批准的治疗库欣综合征的孤儿药。Pa-sireotide对生长抑素受体5的亲和力较高,能抑制促肾上腺皮质激素( adreno cortico tropic hormone,ACTH)的分泌,使库欣综合征患者的皮质醇分泌减少。

3.5 靶向促性腺激素释放激素受体的肽类药物

促性腺激素释放激素受体( gonadotropin-relea-sing hormone receptor ，GnRHR)主要在垂体和生殖系统相关的组织器官中表达,其天然肽类配体促性腺激素释放激素( gonadotropin-releasing hormone,GnRH)是下丘脑分泌产生的一种十肽神经激素,在生殖调控中发挥重要作用。

3.5.1 促性腺激素释放激素受体激动剂

Leuprolide促性腺激素释放激素类似物Leuprolide(亮丙瑞林)是促性腺激素释放激素受体激动剂, 1985年被FDA批准上市,用于治疗激素反应性癌症,例如前列腺癌和乳腺癌,也可用于治疗其它雌激素依赖性疾病,例如子宫内膜异位症和子宫肌瘤。Leuprolide主要通过Gaqm与 GPCR相关联,激活PLC,释放P和DAG,诱导PKC激活,促使垂体前叶释放黄体生成素(luteinizing hormone，LH)和卵泡刺激素( follicle-stimulating hormone，FSH),最终通过下丘脑-垂体-性腺轴的正常生理作用,诱导血清雌二醇和睾酮水平的一过性升高。而下丘脑-垂体-性腺轴的调节依赖于下丘脑促性腺激素释放激素的脉冲分泌,导致Leuprolide 连续几周治疗后促性腺激素释放激素受体敏感性下降。这种促性腺激素释放激素受体活性的长期下调是Leuprolide治疗的主要机制，最终导致黄体生成素和卵泡刺激素分泌减少,性腺功能减退,从而使雌二醇和睾酮水平显著降低,这一点与其他GPCR的激动剂不同。

3.5.2 促性腺激素释放激素受体拮抗剂

Degarelix在激素敏感型前列腺癌的治疗中, Leuprolide所导致的睾酮水平的初始升高反而会使前列腺癌的症状加重,这促使研究者进一步开发了促性腺激素释放激素受体拮抗剂。2008年,FDA批准了一种促性腺激素释放激素受体拮抗剂 Degarelix(地加瑞克) ,用于治疗晚期前列腺癌。Degarelix 与促性腺激素释放激素受体可逆性结合,下调细胞内cAMP含量,通过抑制cAMP依赖的GPCR信号通路减少促性腺激素的释放,进而减少睾酮的释放以阻止前列腺癌的生长和恶化。通过在肽链的第5,6位引入P-脲基苯丙氨酸( p-ureido-phenylalanines ) , Degarelix在实现药物作用时间延长的同时也避免了因组胺释放引起的超敏反应。有研究表明,在治疗晚期前列腺癌方面, Degarelix 优于Leuprolidel。

3.6 靶向加压素/催产素受体的肽类药物

加压素受体( vasopressin receptors，VRs )包括V,xR 、 V,gR和 V,R。V,xR主要在肝、血管平滑肌和血小板中表达,促进血管收缩和血小板聚集; VR主要在垂体中表达,可促进促肾上腺皮质激素的释放;V,R主要在肾集合管中表达,具有抗利尿作用。催产素受体( oxytocin receptors，OTRs)主要分布于子宫和乳腺。加压素( vasopressin)和催产素( oxytocin)均为九肽,主要通过结合其受体来发挥作用, VnR 、VR与催产素受体作用机制相似,主要通过偶联的Gαx.刺激PIC的活性,释放P。和DAG ,诱导内质网Ca*释放;而V,R主要与Go.偶联,激活AC产生cAMP,诱导PKA激活。Carbetocin(卡贝缩宫素)是人工修饰的催产素类似物,天然催产素酚羟基上的氢被甲基取代,半胱氨酸残基上的氨基和硫分别被氢和亚甲基取代,这些修饰延长了Carbetocin 的作用时间。Carbetocin可与子宫平滑肌催产素受体结合,诱导子宫节律性收缩,增加子宫收缩频率和强度,适用于控制分娩后出血。Desmopressin(去氨加压素)是人工合成的九肽化合物,2017年被FDA批准用于治疗中枢性尿崩症,其对V,R作用最强,可通过提高肾集合管上皮细胞cAMP水平促使肾血管舒张发挥抗利尿作用,因此与天然加压素相比, Desmopressin抗利尿作用显著增强,而对平滑肌的作用却减弱,从而避免了高血压引起的不良作用。

3.7 靶向钙敏感受体的肽类药物

钙敏感受体( calcium-sensing receptor ，CaSR ) 广泛分布于甲状旁腺、胃肠道、肾、骨组织等参与调节体内钙稳态的组织器官中。血钙水平升高激活钙敏感受体,从而抑制了甲状旁腺激素的分泌;相反,血钙水平的降低会使钙敏感受体的活性受到抑制,促进甲状旁腺激素的分泌。继发性甲状旁腺功能亢进症( secondary hyperparathy roidism，SHPT)是慢性肾疾病( chronic kidney disease ，CKD)常见的一种慢性进行性并发症。SHPT的特征是甲状旁腺增生引起的甲状旁腺激素水平升高,以及钙和磷等矿物质代谢异常。这些矿物质失衡会导致严重的并发症,例如骨骼疾病、软组织钙化、血管钙化和心血管并发症等。Etelcalcetide(维拉卡肽)是钙敏感受体的一种新型长效肽激动剂,2017年被FDA批准用于治疗成年血液透析患者继发性甲状旁腺功能亢进。Etelca lcetide直接结合开激活中状z陈上的钙敏感受体,通过PLC将PPa红群心多一福使IP,和 DAG,从而抑制甲状旁腺中的甲状旁腺激素分泌。

4 问题与展望

肽类药物以其生物活性尚.1低理、就王板沂特点成为了近年药物研发的热点,尤其是结构上近乎无限的可能性使之更适合于靶向GPCR。然而，噬菌体展示等技术在很大程度上依赖于活性重组蛋白质的制备与固相化,目前尚不能对corkinas.通道、酪氨酸激酶受体( receptor tyrosine kinase，RTK)等跨膜蛋白质进行筛选。另外,基于亲和力的筛选过程并不能区别跨膜蛋白质的激动剂和拮抗剂,即不能进行功能筛选。

Lerner 课题组开发的自分泌信号系统首次实现了哺乳动物细胞中的肽类咫示皮切HE州主穿肽左较噬菌体展示技术,此系统还不能女就E含NNK的筛选,原因在于该体系中肽库丰度是来自含NNK简并密码子( degenerate codons )的PC房法成过质粒构建转化提取、质粒转染L内干细晌染哺乳动物细胞等一系列操作后,最终传手J在以表面的随机肽库丰度存在大幅下降(肽库丰度在以上步骤中不断丢失)。而肽库丰度高低是筛选有效候选肽的关键因素。因此,在Lerner 确立了哺乳动物细胞系肽类展示筛选技术之后,能否在哺乳动物细胞内建立复杂肽库是当前肽类药物开发的一大挑战。

我们课题组开发了一种基于线性双链DNA( linear double-stranded DNA)的“与门(AND Gate)”逻辑基因线路设计新策略。通过PCR反应将完整的基因表达模块(启动子-基因编码区-poly(A)尾信号)拆分为2个线性双链 DNA分子引入哺乳动物细胞,其在细胞内经非同源末端连接(non-homologousend joining，NHEJ) ,或同源重组( homologous recom-bination，HR)机制连接在一起重新形成完整基因表达模块,实现“与门”运算及基因表达(见Fig.2)。

基因表达|北纳生物