2 结果与分析

2.1 HPLC分析

茯苓皮乙酸乙酯萃取物的化学成分比较复杂，为了方便后续溶剂系统的优化，选择峰面积较大的5 个峰作为分离纯化的目标化合物，其保留时间分别为33.46、34.76、36.34、52.73、56.51 min。

2.2 高速逆流色谱溶剂系统的选择

高速逆流色谱的应用中溶剂系统的选择对于样品中不同组分的分离具有决定性的作用，不同的溶剂系统由于极性、密度、黏度的不同都会对化合物的溶解性、分配能力产生影响。所选的溶剂系统应满足以下要求：样品可以稳定的溶解在溶剂系统中；溶剂体系能形成稳定的上下两相，且体积比合适；溶剂系统能对目标化合物提供合适的分配系数；固定相在两相平衡中有较高的保留率。考虑到目标化合物的极性，按照1.3.3节方法分别测定3 种溶剂系统两相分层时间以及对峰1～5五种化合物的分配系数。

在高速逆流色谱分离中，要获得好的分离效果和较高的分离效率，一般要求溶剂系统的分层时间较短（小于30 s），固定相保留率在40%以上，溶剂系统对目标化合物的分配系数在0.5～2之间比较合适。由表1可知，3 种溶剂系统的分层时间都少于30 s。溶剂系统A对化合物1和3的分配系数小，而对化合物4和5的分配系数又过大，表明这些目标化合物在溶剂系统中在某一相中溶解性较好，这不利于这些化合物的分离。C溶剂系统对化合物4和5的分配系数较大，使其较好地溶解在固定相中，分离时间长，不利于其分离。因此综合考虑以上因素，选择溶剂系统B作为本实验的高速逆流色谱溶剂系统。

2.3 高速逆流色谱操作条件的选择

在高速逆流色谱分离过程中，除溶剂系统外，分离条件也直接影响分离结果。在高速逆流色谱主机正转，转速800 r/min时，分别在不同流速（2、3、4 mL/min）和不同进样量（50、100、150 mg）条件下采集分离过程中波长242 nm处的色谱图。比较分离结果发现，增加分离过程的流速可以缩短分离所需时间，当流速达到4 mL/min时，峰III和峰IV的分离度较低，分离过程中可能会相互影响使分离得到的化合物纯度不高，因此分离流速选择3 mL/min。除此之外，进样量的增加使得各分离峰的峰面积增大，当进样量达到150 mg时，出峰时间接近的峰III和峰IV相互重合，无法分离。综上所述，本实验采用高速逆流色谱分离操作条件进样量100 mg、流速3 mL/min。

2.4 高速逆流色谱分离结果

采用正己烷-乙酸乙酯-甲醇-水（3∶6∶4∶2，V/V）的溶剂系统，按照优化的分离操作条件进行高速逆流色谱分离，平衡过程共流出固定相150 mL，该型仪器的总柱体积为300 mL，按1.3.5节方法计算保固定相保留率为50%。将峰I～IV对应的组分进行HPLC分析，结果表明峰I和峰II的杂质较多，三萜含量较少，没有进一步分析价值。峰III和峰IV三萜的纯度较高，其保留时间和纯度分别为：峰III，33.23 min，90%；峰IV，36.20 min，92%。由对应插图可知，2 个色谱峰均在波长242 nm处有最大吸收，符合三萜类化合物的紫外吸收特征。

2.5 结构表征

将高速逆流色谱分离得到的2 个组分进行冷冻干燥后，得1号化合物5.2 mg（峰III）和2号化合物20.5 mg（峰IV）。经超高液相色谱-离子淌度四极杆飞行时间质谱、1H NMR和13C NMR鉴定1号化合物为茯苓酸B，2号化合物为茯苓酸A。

化合物1：白色无定型粉末（甲醇）。化合物在紫外光谱中的最大吸收波长为242 nm，ESI-MS m/z：483 [M－H]－，409 [M－CH3CH2COOH]－。如表2所示，1H NMR谱中δH 1.50、1.58、0.99、0.93、1.50、1.68为6 个甲基单峰质子，δH 4.67、4.76为环外双键质子，δH 5.17、5.21为环内双键质子，推测该化合物具有共轭双键结构，δH 4.54为与羟基相连的碳原子上的质子信号。13C NMR谱中共显示30 个碳信号，δC 178.3、180.0为2 个羧基所在位置的碳信号，δC 119.0、120.7和142.3、138.3分别为2 个烯属的次甲基和2 个烯属季碳的共振信号，结合1H NMR谱信息推测该化合物为3,4-开环-羊毛甾-7,9(11)-二烯型三萜。综合上述分析，与相关文献[27-28]对照，鉴定化合物1为茯苓酸B。

化合物2：白色无定型粉末（甲醇）。化合物在紫外光谱中的最大吸收波长为242 nm，ESI-MS m/z：497 [M－H]－，423 [M－CH3CH2COOH]－。如表3所示，其数据与化合物1极为相似，推测化合物2与化合物1具有相同的骨架类型。13C NMR谱中数据与化合物1相比，δC 25 132.6向高场移至33.6，δC 24 124.9向低场移至155.3，同时由化合物2中δC 31 106.7推测其环外的双键类型由化合物1中的24（25）型双键变成24（31）型的双键。以上数据与相关文献报道对照基本一致，故鉴定化合物2为茯苓酸A。

3 结 论

茯苓皮作为茯苓加工的副产物，其中的活性成分三萜类化合物的总含量达到1.58%，因此开发利用茯苓皮中的三萜类化合物具有重要意义。茯苓三萜分离制备的传统方法主要依靠柱色谱、薄层色谱等方法相结合进行反复的分离纯化，鉴于这些方法存在步骤复杂，溶剂消耗量大，得率较低的缺点，有研究者采用高速逆流色谱技术分离茯苓中的三萜类化合物。王艳等以大孔树脂初分后茯苓皮乙醇提取物为样品，利用高速逆流色谱在5 h内分离得到了纯度为98%的茯苓酸A；Dong Hongjing等采用酸碱萃取的方法将茯苓醇提物分为两部分进行高速逆流色谱分离，分别在5 h和7 h内共分离得到纯度为80.1%到96.4%的6 种三萜酸组分。综上，有关于高速逆流色谱分离茯苓皮中三萜类化合物的报道较少，尚缺少溶剂系统筛选、分离条件优化以提高分离效率的报道。

本实验应用高速逆流色谱从茯苓皮中分离出了2 种三萜类化合物茯苓酸A和茯苓酸B。高速逆流色谱的溶剂系统为正己烷-乙酸乙酯-甲醇-水（3∶6∶4∶2，V/V），分离条件为主机正转、转速800 r/min、进样量100 mg、流速3 mL/min，在3 h内即完成分离。经质谱和核磁鉴定2 种组分分别为茯苓酸A和茯苓酸B，其纯度分别达到92%和90%。本实验建立了一种快速有效分离制备茯苓皮中茯苓酸A和茯苓酸B的高速逆流色谱方法，为进一步研究茯苓中的化学成分、药理活性及其有效成分的加工利用提供一定的理论基础。