RT-ddPCR技术检测食品中诺如病毒（二）

2 结果与分析

2.1 引物探针筛选结果

根据NoV基因型分型保守区域分别设计出3 组GI型NoV引物、探针和4 组GII型NoV引物、探针，引物探针序列未给出。荧光PCR筛选结果表明，针对GI型和GII型NoV的各组引物探针均能有效扩增出靶基因，其中来源于GB 4789.42—2016《食品微生物学检验 诺如病毒检验》的引物探针COG1-F/R/RING1-P和COG2-F/R/RING2-P具有较高的扩增效率，可筛选分别用于构建GI、GII型NoV RT-ddPCR体系。对其特异性进行验证（图1）。荧光PCR特异性验证结果表明，筛选的GI型NoV特异性COG1-F/COG1-R/RING1-P、GII型NoV引物探针COG2-F/COG2-R/RING2-P和MS2噬菌体引物探针MS2-TM3-F/R/P特异性良好，各筛选的引物探针序列见表1。

图1 荧光PCR筛选引物探针

表1 筛选的RT-ddPCR引物探针序列

注：*.存在Kageyama引物，Y为C或T，R为A或G，B为非A的其他碱基，N为任意碱基。

RT-ddPCR特异性验证结果表明，3 个RT-ddPCR体系只有各自对应目的片段特异性扩增，其余病毒经检测均呈阴性，证明筛选的3 组引物探针在RT-ddPCR体系中特异性良好（图2）。

图2 RT-ddPCR检测方法特异性实验结果

2.2 RT-ddPCR检测体系优化结果

由图3A、B可见，50 ℃条件下GI、GII型NoV目的基因片段的扩增效率均偏低，阳性微滴和阴性微滴分界不明显；55 ℃和60 ℃条件下目的基因片段扩增效率较高，可出现比较明显的阳性微滴簇，且55 ℃条件下扩增的荧光信号略高于60 ℃，因此，将55 ℃作为GI和GII型NoV RT-ddPCR检测体系的最佳最火温度；由图4C可见，55 ℃条件下MS2噬菌体目的片段的扩增效率偏低，阳性微滴和阴性微滴分界不明显；57.5、60 ℃和62.5 ℃条件下目的基因片段扩增效率较高，阳性微滴和阴性微滴可明显分解，且62.5 ℃条件下扩增的荧光信号略高于57.5 ℃和60 ℃，因此，将62.5 ℃作为最佳退火温度。

图3 RT-ddPCR检测体系在不同退火温度下扩增结果

2.3 RT-dd PCR检测体系的定量限和准确度

对于MS2噬菌体RNA，5 次重复测量得到的核酸浓度平均值为1.269 μg/mL（测量结果未给出）。MS2噬菌体为单链RNA病毒，基因组由3 569 个核苷酸组成，故计算得到的MS2噬菌体RNA拷贝浓度为6.29×108 拷贝/μL。

将GI、GII型NoV RNA标准物质和MS2噬菌体RNA分别按多倍梯度稀释，直至稀释浓度分别为5.4、5.9 拷贝/μL和6.29 拷贝/μL，每个梯度4 个重复实验，分别进行RT-ddPCR检测。结果表明，GI和GII型NoV的RT-ddPCR检测最后两个稀释倍数的RSD均较大，但是均在25%以内，表明这两个检测体系的绝对定量检测灵敏度均可达到5 拷贝/μL；而MS2噬菌体RT-ddPCR检测RSD为4.5%～42.0%，对单个拷贝浓度样品的4 次重复的RSD达到42%，故MS2噬菌体RT-ddPCR检测的绝对定量检测灵敏度可达到10 拷贝/μL梯度。

3 个体系所检测的浓度值与相应的理论浓度值均具有很好的线性关系，并且与理论拷贝数相符，3 个RT-ddPCR检测体系分别能够对GI、GII型NoV和MS2噬菌体进行准确定量。

2.4 RT-dd PCR检测体系的重复性

对于高浓度样品和低浓度样品，3 个RT-ddPCR检测体系的RSD 均小于25%，与理论值的偏差为0.34%～15.63%，单因素方差分析发现，各RT-ddPCR检测体系的3 个重复检测值之间无显著差异（P＞0.05），可见RT-ddPCR检测体系的重复性均较好。进一步分析数据发现，高浓度样品3 个平行样品的测定RSD总体上低于低浓度样品，可见模板的浓度对RT-ddPCR检测体系的重复性影响较大，样品浓度范围在103～101数量级范围内时，RT-ddPCR检测体系能够较好地对目的模板进行定量检测。

2.5 MS2噬菌体对食品中NoV RT-ddPCR定量检测结果的影响

贝类消化腺（牡蛎消化腺）、硬表面食品（苹果）、生食蔬菜（羽叶生菜）和软质水果（草莓）4 种食品基质中，添加与未添加MS2噬菌体过程控制的平行样品，GII型NoV定量检测结果相近，t检验结果P值均大于0.05，差异无统计学意义。4 种食品基质过程控制回收率分别均大于1%，均符ISO/TS要求。添加了MS2噬菌体的样品可通过将GII型NoV定量检测结果除以回收率，得到NoV载量，均达到了106 拷贝数量级，RSD为2.4%。

2.6 食品中NoV RT-ddPCR定量检测方法的应用

实际样品检测结果表明（具体数据未给出），在23 份贝类样品中有2 份检出GII型NoV RNA，检出率为8.70%。硬表面食品、生食蔬菜和软质水果样品中均未检出食源性病毒。不同的食品基质中MS2噬菌体作为过程控制的回收率不同，贝类消化腺中的过程控制回收率在18.2%～78.6%之间，硬表面食品中的过程控制回收率在9.4%～58.2%之间，生食蔬菜中的过程控制回收率在8.5%～32.2%之间，软质水果中的过程控制回收率在1.7%～19.9%之间。

3 讨论

NoV是引起急性暴发非细菌性胃肠炎的首要致病原体，美国疾病控制与预防中心监测研究估计30%～50%的食物源性胃肠炎暴发与NoV有关。NoV通过污染肥料或水体进入食物链，被污染的水体中生长的滤食性贝类，可浓缩水体中的NoV，当人类生食来自被NoV污染水体中的贝类或者食用未熟透的贝类时，可感染NoV；此外携带了NoV的食品加工者也可能将病毒颗粒转移到食品上。由此可见，被NoV污染的食物是其传播的关键，建立科学、高效的食品中NoV检测手段，对控制NoV引起的疾病，保障人民健康具有重要意义。

数字PCR技术将PCR体系分割为许多独立的反应单元，模板在独立的反应单元中进行PCR扩增，检测每个反应单元是否有荧光信号判断是否含有扩增模板，通过泊松统计学处理，不依赖标准曲线和循环阈值可直接定量核酸拷贝数。定量检测RNA时，需要将RNA反转录为cDNA。Kiselinova等在两步法反转录数字PCR对定量检测HIV RNA时，仍然需要依赖标准曲线计算RNA的拷贝浓度。RT-ddPCR可避免反转录给定量结果带来的偏倚，目前已有研究成功利用RT-ddPCR实现水体中的RV RNA直接定量检测，灵敏度与real-time PCR相当。

本研究以实验室保存的GI、GII型NoV RNA标准样品为模板，分析构建的NoV RT-ddPCR检测体系的检出限包括104～100 拷贝/μL 5 个数量级。RT-ddPCR对高浓度模板样本检测能力受限，主要原因是ddPCR平台仅可生成小于20 000 个微滴，当模板浓度达到106 拷贝/μL数量级，不能通过泊松分布计算模板含量。但是对于低浓度模板样本，RT-ddPCR具有较小的变异系数和更高的灵敏度，Tang Hui等结果表明，ddPCR具有更好的可重复性，对低拷贝的质粒标准品的定量检测优于实时荧光PCR。Yan Yong等发现，dd PCR能够从real-time PCR检测阴性的咽拭子标本中检测出流感病毒载量，其检测灵敏度更高。

基于RT-ddPCR技术的食品中NoV定量检测方法，需要构建过程控制程序，采用的模式病毒应具备以下条件：1）可建立RT-ddPCR检测体系，具有与NoV相当的准确性、灵敏度和变异性；2）容易培养，无生物危害，能够确定效价[20]；3）与NoV基因有明显区别，不影响检测结果；4）在自然状态中不出现，只能人为添加到被检测食品中。MS2噬菌体是一种无包膜+ssRNA病毒，侵染宿主为F+（雄株）大肠埃希氏菌，大小和结构与NoV比较接近，可通过计数噬菌斑确定其效价，对人体没有致病性，基因组不含NoV的靶基因序列[23-24]。本研究建立了MS2噬菌体RT-ddPCR检测体系，准确性、定量限和重复性与NoV RT-ddPCR检测体系相当，且不影响食品中NoV的RT-ddPCR定量结果，因此，可作为过程控制的模式病毒被添加到食品中指示回收率，计算食品中NoV的实际载量。

本研究建立了基于RT-ddPCR技术的食品中NoV定量检测方法，可定量检测单个拷贝数量级的NoV核酸。NoV通常富集或吸附于不同食品基质内部或者表面，需要经过病毒洗脱浓缩、核酸提取纯化等前处理，才能对食品中的NoV进行定量检测，但是前处理过程往往可导致NoV颗粒大量损失，造成RT-ddPCR定量结果与食品中NoV实际载量不匹配的现象。由此可见，后续需要针对优化NoV洗脱浓缩，改善核酸提取效率，提高NoV整体回收率等方面进一步研究，以提升RT-ddPCR检测体系对食品中NoV定量检测的准确性。

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