美拉德反应受较多因素的影响，反应体系的底物是其中一个极其重要的因素［1-9］。美拉德反应底物包括糖类和氨基化合物。由于双糖产生的风味较差、成本高，所以在香精的生产过程中，通常使用葡萄糖和木糖［10-11］作为反应底物。而氨基化合物也是美拉德反应的必要底物，若没有蛋白质、肽或氨基酸参与反应，也就无法形成风味物质。目前对于美拉德反应的研究主要集中在分析美拉德反应的影响因素和反应条件的优化，但对其香气成分和有害物质的研究较少。碳水化合物在高温下易生成丙烯酰胺及5-羟甲基糠醛（5-hydroxymethylfurfural，5-HMF）。丙烯酰胺是具有神经毒性、生殖毒性、发育毒性以及致癌性等［12-15］的潜在致癌物。一定剂量的5-HMF被机体吸收后，会对肝脏、肾脏、心脏等器官产生不良影响，而且对眼黏膜、上呼吸道黏膜、人体横纹肌及内脏有损害［16-19］。当前我国对于食品中丙烯酰胺和5-HMF还没有相关的限量标准。

本实验以氨基酸（半胱氨酸、甘氨酸及谷氨酸）和还原糖（木糖、葡萄糖）为主要原料，在合适的加水量、反应时间、和反应温度下进行美拉德反应，利用气相色谱-质谱联用仪（gas chromatography-mass spectrometer，GC-MS）对其挥发性反应产物进行分析，研究不同反应底物对美拉德反应产物风味的影响，同时利用高效液相色谱法对丙烯酰胺和5-HMF进行检测，探讨不同美拉德反应底物对其含量的影响。本实验旨在为美拉德反应产物的进一步分析提供理论基础，也为制定食品中丙烯酰胺和5-HMF的安全限量标准提供参考。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

甘氨酸（99.5%～100.5%）、L-半胱氨酸（99.0%）、D-谷氨酸（98.0%）、5-HMF（98.0%）、丙烯酰胺（99.0%）、亚铁氰化钾（99.0%）、乙酸锌（99.0%）、甲醇 阿拉丁试剂公司；木糖 唐利康木糖厂家；葡萄糖 广州化学试剂厂；氯化钠 天津市福晨化学试剂厂。以上试剂均为分析纯。

1.2 仪器与设备

FA2004电子天平 上海良平仪器仪表有限公司；YP1201N电子天平 上海精密科学仪器有限公司；SYQ-DSX-280B手提式不锈钢压力蒸气灭菌器 上海申安医疗器械厂；SFG-02.300电热恒温鼓风干燥箱 黄石市恒丰医疗器械有限公司；BCD-198H离心机 上海安亭科学仪器厂；SHZ-D循环水式真空泵 巩义市予华仪器有限责任公司；1100 Series高效液相色谱仪 美国安捷伦公司；N6890c-5973ineit 气相色谱-质谱联用仪 美国安捷伦公司；85-2A数显恒温磁力搅拌器 江苏金坛市金城国胜实验仪器厂。

1.3 方法

1.3.1 美拉德反应产物的制备

第一组样品反应物配比：氨基酸1.00 g、木糖1.00 g、葡萄糖0.50 g、水40.00 g。其中，样品1、2、3中氨基酸分别为半胱氨酸、甘氨酸和谷氨酸；样品4、5、6中氨基酸分别分半胱氨酸+甘氨酸（1∶1，m/m，下同）、半胱氨酸+谷氨酸（1∶1）、甘氨酸+谷氨酸（1∶1）；样品7中氨基酸为半胱氨酸+甘氨酸+谷氨酸（1∶1∶1）。

第二组样品反应物配比：氨基酸1.00 g、还原糖1.00 g、水40.00 g。其中，样品8、9中氨基酸为半胱氨酸；样品10、11中氨基酸为甘氨酸；样品12、13中氨基酸为谷氨基；样品14、15中氨基酸为半胱氨酸+甘氨酸（1∶1）；样品16、17中氨基酸为半胱氨酸+谷氨酸（1∶1）；样品18、19中氨基酸为甘氨酸+谷氨酸（1∶1）；样品20、21中氨基酸为半胱氨酸+甘氨酸+谷氨酸（1∶1∶1）。样品8、10、12、14、16、18、20中还原糖为木糖，样品9、11、13、15、17、19、21中还原糖为葡萄糖。

将反应物置于50 mL的三角瓶中，编号，塞紧棉塞，放进手提式不锈钢压力蒸汽灭菌器，在115 ℃条件下，反应60 min。

1.3.2 美拉德反应产物的感官评价

由10 名较有经验的评分员（5 男5 女）对所制得的美拉德反应产物进行感官评分及简单描述。方法如下［5］：待反应完后的香精冷却到室温，将闻香纸浸入反应完的香精中1～2 cm深，然后在距离评分员2～3 cm处通过2～3 s。评分员给为闻香纸散发的气味进行评分，总分以各项平均分记录，评分内容见表1。液体状态分值说明：分值越高表示液体越澄清香型分值说明：香味等分值高，苦味或者异味分值低；强弱分值说明：气味越强分值越高；留存时间分值说明：香味留存时间越长分值越高；异味分值说明：苦味等不好的味道越多，扣除分越多。

1.3.3 香气成分的测定

气相色谱条件：色谱柱为HP-5MS（30 m× 0.25 mm，0.25 μm）毛细管柱；进样量1 μL；进样口温度：260 ℃；柱温程序：起始温度40 ℃，保留2 min，以5 ℃/min的速率升温至120 ℃，再以12 ℃/min的速率升温至250 ℃，保持3 min，最后以10 ℃/min的速率升温至260 ℃，后运行30 min；载气：氦气，流速：0.76 mL/min。

质谱条件：EI源，电离电压70 eV；离子源温度230 ℃；质量扫描范围50～550 amu。

1.3.4 丙烯酰胺含量的测定

参考文献［20-25］的方法。取10 mL样品溶液于20 mL离心管中，分别添加0.2 mL的亚铁氰化钾溶液（15 g/100 mL）和乙酸锌溶液（30 g/100 mL），剧烈混匀后于3 500 r/min， 4 ℃条件下离心15 min，取上清液1 mL用0.45 μm的聚偏氟乙烯（polyvinylidene fluoride，PVDF）微孔滤膜过滤后进行高效液相测定。

检测条件为：色谱柱：ZORBAX Eclipse Plus C18柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流动相：甲醇-水（体积比为5∶95）；流速：1.0 mL/min；柱温：30 ℃；检测波长：210 nm；进样量：5 μL。

1.3.5 5-HMF的测定

样品前处理方法同丙烯酰胺。

检测条件为：色谱柱：ZORBAX Eclipse Plus C18柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流动相：甲醇-水（体积比为5∶95）；流速：1.0 mL/min；柱温：30 ℃；检测波长：285 nm；进样量：5 μL。

相关链接：氨基酸，半胱氨酸，甘氨酸，谷氨酸，木糖，葡萄糖，丙烯酰胺，甲醇，北纳生物

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