离子色谱法测定尿液中草酸（二）

2 结果与讨论

2.1 色谱条件的选择

2.1.1 淋洗液的选择

以 SH–AC–3 型阴离子交换柱为分离柱，以 Na2CO3–NaHCO3 溶液为淋洗液，取模拟尿样进行测 定，考察淋洗液对各组分的分离效果。当 Na2CO3– NaHCO3 淋洗液的浓度配比在 6∶1～6∶3 mmol／L 时，均可将草酸和硫氰酸盐与尿液中的氯化物、磷酸盐和硫酸盐等常见阴离子完全分离，各组分相对于 后续组分的分离度（R）不小于 1.5，但硫氰酸盐的保 留时间（t）超过 24 min，分析效率低下。为缩短硫氰酸盐的保留时间，提高分析工作效率，以洗脱能 力较强的 Na2CO3 溶液进行了淋洗试验，设置流量 为 1.0 mL／min，试验结果列于表 1。由表 1 可知， 当 Na2CO3 溶液浓度分别为 8.0、10.0、12.0 mmol／L 时，草酸和硫氰酸盐与尿液中的氯化物、磷酸盐和硫酸盐（当 Na2CO3 溶液超过 8 mmol／L 时磷酸盐 和硫酸盐合并为一个色谱峰）等阴离子均可完全分 离，且硫氰酸盐的保留时间分别缩短至 21、20 和 19 min 左右。考虑到 Na2CO3 溶液浓度增大，相应的 抑制电流也高，不利于抑制器的使用，为保证适 宜的分离度和较短的保留时间，选择 10.0 mmol／L Na2CO3 溶液为淋洗液。

表 1 Na2CO3 溶液浓度对分离结果的影响

2.1.2 色谱柱的选择

以 10.0 mmol／L Na2CO3 溶液为淋洗液，流量 为 1.0 mL／min 进行等度洗脱，取模拟尿样进行测 定，考察了青岛盛瀚色谱公司生产的 SH–AC–1 型 和 SH–AC–3 型阴离子交换柱对草酸和硫氰酸盐与 氯化物、磷酸盐和硫酸盐等常见阴离子的分离情况。 结果表明，在此条件下 SH–AC–1 型柱虽能将草酸 与常见阴离子完全分离，但硫氰酸盐在 90 min 内尚 未出峰；而 SH–AC–3 型柱不但可将草酸和硫氰酸 盐与氯化物、磷酸盐和硫酸盐等常见阴离子完全分 离，且硫氰酸盐的保留时间小于 21 min。故本实验 选择 SH–AC–3 型阴离子交换柱为分离柱。

2.1.3 淋洗液流量的选择

淋洗液浓度相同，流量不同时，组分的分离 度和保留时间会发生改变。考察 10.0 mmol／L Na2CO3 为淋洗液，不同流量时草酸和硫氰酸盐与 氯化物、磷酸盐和硫酸盐等阴离子的分离效果，试 验结果列于表 2。由表 2 可知，当淋洗液流量从 0.8 mL／min 增加至 1.2 mL／min 时，氯化物、磷酸盐和 硫酸盐、草酸和硫氰酸盐的保留时间逐渐变短，分 离度逐渐下降，但氯化物、磷酸盐和硫酸盐、草酸的 分离度远大于 1.5 达到完全分离的标准。在保证待 测组分与干扰离子完全分离的前提下尽量使用较 低的流量，以减少系统压力，因此淋洗液流量选定 为 1.0 mL／min。

表 2 不同 Na2CO3 淋洗液流量试验结果

2.1.4 柱箱温度的确定

考察了柱温分别在 30、35、40 ℃时各组分的分 离效果，结果显示，在所选温度下，草酸和硫氰酸盐 均能与氯化物、磷酸盐和硫酸盐等常见阴离子完全 的分离，且随着柱温的升高组分的保留时间稍微缩 短，分离度逐渐下降，草酸的色谱峰面积随着柱温的 升高而增长，从 30 ℃上升 35 ℃，增长 10% 左右，从 35 ℃上升 40 ℃，增长 6% 左右；硫氰酸盐的色谱峰 面积随着柱温的升高基本保持不变。在保证适宜的 保留时间和较高的分离度的情况下，尽量采用较低 的柱温，本试验确定柱箱温度为 35 ℃，这也是色谱 柱使用说明书推荐的使用温度。

2.2 线性关系与检出限

按照 1.2 配制系列混合标准工作溶液，测定各 管的色谱峰面积，以色谱峰面积（S）为纵坐标，以各 组分的质量浓度（c）为横坐标绘制标准曲线，进行 线性回归。 测定仪器 30 min 的基线噪声，以 3 倍基线噪声 除以标准曲线的斜率（3N／b）计算草酸和硫氰酸盐 的检出限。 其线性范围、回归方程、相关系数（回归曲线的 截距、斜率和相关系数由仪器软件给出）、检出限列。草酸和硫氰酸盐的质量浓度在0.20～30.0 mg／L范围内与色谱峰面积线性良好，线性相关系数分别为 0.999 29、0.999 49，检出限分别为 0.04、0.03 mg／L。

2.3　共存阴离子及抗坏血酸的影响

由于尿液中含有大量的有机物和氯化物、磷酸盐和硫酸盐等阴离子，尿样通过 C18 柱的净化可以消除有机物的影响，尿液经 10 倍稀释以降低氯化物、磷酸盐和硫酸盐的影响。考察了氯化物等 3 种阴离子对草酸和硫氰酸盐测定结果的影响，结果表明，氯化物、磷酸盐和硫酸盐的保留时间远小于草酸和硫氰酸盐的保留时间，且 500 mg／L Cl–、300 mg／L H2PO4–、SO42–（H2PO4–、SO42– 完全分不开合并为一个峰）不影响 50 mg／L 的草酸、3 mg／L 的硫氰酸盐的测定，分离色谱图见图 1。

图 1　常见阴离子与草酸和硫氰酸盐分离色谱图

尿液中可能含有抗坏血酸，在碱性条件下，抗血酸易发生降解反应，而草酸是抗坏血酸的降解产物之一，可能会影响草酸的准确测定，有研究显示在 15.0 mmol／L NaHCO3 溶液 (pH=8.3) 中 40 mg／L 的抗坏血酸在 80 min 内未降解为草酸，本试验使用 10.0 mmol／L Na2CO3 溶液（pH ≈ 11.1）为淋洗液，pH 值远大于 8.3，样品从进样到草酸出峰超过 11 min，这段时间尿液中的抗坏血酸可能降解生成草酸而影响测定。观察用纯水配制 30 mg／L的抗坏血酸的降解情况，结果表明本试验条件下 30 mg／L 的抗坏血酸降解产生约 0.3 mg／L 的草酸。试验采用亚硫酸盐（SO32–）抑制抗坏血酸的降解，这在易氧化药物制剂中加入亚硫酸盐以提高药物稳定性的方法原理相似。

试验结果显示，50 mg／L 的 SO32– 可抑制 30 mg／L 抗坏血酸的降解，且至少在 120 min 内 30 mg／L 抗坏血酸对 10.0 mg／L 的草酸的色谱峰面积与峰高无明显影响（增加值 <5%）。同时 50 mg／ L 的 SO32– 对草酸和硫氰酸盐的测定结果无明显影响（误差 <5%）。

2.4　加标回收试验

取 3 份 1.5 mL 样液于样品瓶中，按 1.6 步骤操作，测得草酸和硫氰酸盐的含量。在 3 份尿样中分别添加 2.0、5.0、10.0 mg／L 的草酸和硫氰酸盐，平行测定 5 次，并计算草酸和硫氰酸盐的回收率及测定结果的相对标准偏差，结果见表 3。由表 3 可知，3 份尿液草酸和硫氰酸盐的测定结果分别为 4.71～14.83 mg／L 和 0.21～0.72 mg／L，加标回收率分别为 95.0%～101.1% 和 95.5%～100.5%，测定结果的相对标准偏差分别为 1.34%~2.06% 和1.56%~2.91%。

表 3　加标回收试验结果样品

3　结语

本文呢建立了抑制电导检测 – 离子色谱法同时测定尿液中草酸和硫氰酸盐的分析方法。该方法具有 良好的重现性和准确性，操作简便快速，尿样通过 C18 柱的净化可以消除有机物的影响，尿液稀释 10 倍后可降低氯化物、磷酸盐和硫酸盐的影响。该方 法以自动进样器进样，降低检验人员的工作强度， 提高了工作效率，适用尿液中草酸和硫氰酸盐的同时测定。

相关链接：磷酸盐，硫酸盐，色谱峰，抗坏血酸，抑制，氯化物，有机物，北纳生物

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