氨基酸是构成人体营养所需蛋白质的基本物质，常被加入到特医食品中，起到促进发育、调节人体代谢等作用；牛磺酸（Tau）与胱氨酸的代谢密切相关，并且结构与氨基酸类似，被称为类氨基酸物质。目前，GB 25596—2010《特殊医学用途婴儿配方食品通则》可用于特殊医学用途婴儿配方食品的氨基酸有19种，但是并未给出相应的检测方法。国内关于食品中氨基酸的检测标准仅有GB 5009.124—2016《食品中氨基酸的测定》，该标准规定了16种氨基酸的检测方法，没有覆盖GB 25596—2010中包含的胱氨酸、色氨酸以及谷氨酰胺3种氨基酸的检测。GB 25596—2010规定了Tau的添加量为0～3 mg/100 kcal，而GB 5009.169—2016《食品中牛磺酸的测定》检测范围不包括特殊医学用途婴儿配方食品。

国内外报道的氨基酸检测涉及的研究对象大多为生物样品或普通食品，而Tau的研究对象多为婴幼儿配方乳粉和饮料；对特殊医学用途婴儿配方食品中氨基酸和Tau的同时检测鲜有报道。由于医用食品因其特殊的功能性用途，产品基质和结构成分与婴幼儿配方乳粉及普通食品有着较大的区别，使得常规食品或婴幼儿配方乳粉中氨基酸和Tau的检测方法在医用食品检测领域难以直接应用。

目前，氨基酸和Tau的检测技术主要有氨基酸分析仪、高效液相色谱仪及液相色谱-串联质谱仪等。GB 5009.124—2016采用的是离子交换茚三酮柱后衍生的方法，该方法中使用的氨基酸自动分析仪价格昂贵、用途专一、灵活性差，大大限制了其推广和使用。而液相色谱分析法，普适性广，具有分析速度快、灵敏度高、操作简单等优点，已成为检测氨基酸的首选方法。因氨基酸和Tau属于极性大且无紫外吸收的一类化合物，故需进行衍生化。常用的衍生剂有异硫氰酸苯酯、2,4-二硝基氟苯、邻苯二甲醛、9-氯甲酸芴甲酯、OPAFMOC联用、丹磺酰氯、6-氨基喹啉基-N-羟基-琥珀酰亚氨基甲酸酯等。

DNFB衍生过程中能够产生对测定结果有干扰的副产物，PITC衍生试剂具有挥发性且毒性较大，需真空干燥装置去除过量衍生剂，FMOC衍生过量的反应剂必须用戌烷萃取除去；OPA衍生产物在室温不稳定，分解率高；Dansyl-Cl反应活性较差，反应速度慢，且易生成多级衍生产物干扰测定。AQC可与伯胺和仲胺反应生成稳定的衍生物脲，其衍生物有很强的紫外吸收和荧光吸收，衍生操作简单，衍生速度快，过量的试剂能自然水解，不需要特殊的处理或提取；而且还不受样品基质、大量电解质、维生素和微量元素的干扰，特别适用于食品等复杂基质中氨基酸的分析。

本研究针对检测标准中检测对象覆盖不全、检测范围不包含医用食品，无法满足监管需求的问题，采用AQC衍生，建立超高效液相色谱同时测定特殊医学用途婴儿配方食品中19种游离氨基酸和Tau的检测方法，填补医用食品中氨基酸和Tau检测标准空白和技术缺失，可以为殊医学用途婴儿配方食品的质量控制和监管提供技术支持。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

实验用特殊医学用途婴儿配方食品：无乳糖配方、乳蛋白部分水解配方、乳蛋白深度水解配方、氨基酸配方、早产/低出生体质量婴儿配方、氨基酸代谢障碍配方、母乳营养补充剂均为市售。

标准品：天冬氨酸（Asp，纯度≥99.7%）、丝氨酸（Ser，纯度≥99.9%）、谷氨酸（Glu，纯度≥ 98.0%）、组氨酸（His，纯度≥99.9%）、精氨酸（Arg，纯度≥91.3%）、苏氨酸（Thr，纯度≥ 99.9%）、脯氨酸（Pro，纯度≥99.5%）、酪氨酸（Tyr，纯度≥99.6%）、缬氨酸（Val，纯度≥ 99.4%）、蛋氨酸（Met，纯度≥98.3%）、赖氨酸（Lys，纯度≥88.1%）、异亮氨酸（Ile，纯度≥ 99.5%）、亮氨酸（Leu，纯度≥99.9%）、苯丙氨酸（Phe，纯度≥99.4%）、谷氨酰胺（Gln，纯度≥ 99.2%）、色氨酸（Trp，纯度≥99.6%），均购自Dr. Ehrenstorfer GmbH公司；丙氨酸（Ala，纯度≥ 99.8%）、胱氨酸（Cys，纯度≥99.9%），均；甘氨酸（Gly，纯度≥99.0%） 中国计量科学研究院；Tau（纯 度≥99.8%） 。

乙腈（色谱纯） 美国Fisher公司；甲酸（色谱纯）、Waters AccQ-Tag氨基酸测定试剂盒（AccQ-Fluor 试剂盒（包括硼酸缓冲液1、衍生剂粉2A、稀释 液2B））；α-淀粉酶（活力≥1.5 U/mg） 美国Sigma-Aldrich公司；甲酸铵（色谱纯） 美国Fisher公司；盐酸（优级纯）、氢氧化钠（分析纯） 国药集团化学试剂有限公司；有机微孔滤膜（0.22 μm） 上海安谱科学仪器有限公司。

1.2 仪器与设备

H-CLASS超高效液相色谱仪（配备二极管阵列检 测器） 美国Waters公司；AB204-S型电子天平 瑞士 Mettler Toledo公司；SB-800DTD型超声波清洗器 宁波新芝生物科技股份有限公司；3-18K型冷冻离心机 德国Sigma公司；MS3涡旋混合器 德国IKA公司；SW22型恒温水浴振荡摇床 优莱博技术（背景）有限公司；Milli-Q超纯水制备器 美国Millipore公司。

1.3 方法

1.3.1 标准溶液的配制

标准储备液（10.0 mmol/L）：分别准确称取适量（精确至0.1 mg）标准品于10 mL容量瓶中，分别用0.1 mol/L盐酸定容至刻度。

标准工作溶液：将以上各标准储备液稀释，配成混合标准溶液，使用前逐级稀释至各组分均为3.0、5.0、10.0、25.0、50.0、100.0、200.0、250.0 μmol/L的系列标准工作溶液，待用。

1.3.2 样品前处理

1.3.2.1 提取

样品混匀后称取1 g（精确到0.000 1 g）至50 mL离心管中，加入20 mL 45～50 ℃的水，混匀。充分摇匀，加入0.1 g α-淀粉酶，混匀后，置于（55±5）℃的恒温水浴振荡摇床中30 min。取出，冷却至室温后，用盐酸溶液调节试样溶液的pH值至1.7±0.1，放置约2 min后，再用氢氧化钠溶液调pH值至4.5±0.1后，超声约10 min。将试样溶液转移至25 mL容量瓶中，用水冲洗比色管，洗液合并于25 mL容量瓶中，加水定容后，摇匀，样液全部转移至50 mL离心管中，8 000 r/min离心5min，上清液经0.22 μm有机相微孔滤膜过滤后待用。

1.3.2.2 衍生

AccQ-Fluor衍生剂的制备：吸取2B瓶中1 mL AccQFluor稀释剂放入装有AccQ-Fluor衍生剂粉末的2A瓶中，加盖密封，涡旋10 s，在55 ℃加热装置上加热2A瓶，直至AccQ-Fluor衍生剂粉末全部溶解，加热时间不超过10 min。密封，室温下保存于干燥器中，有效期1 周。

衍生样品或标准溶液：移取10 μL标准工作溶液或1.3.2.1节的样品提取液于6 mm×50 mm试管的底部，加入70 μL AccQ-Fluor硼酸盐缓冲液（Buffer 1）涡旋混合后，加入20 μL AccQ×Fluor衍生剂，立即涡旋混合，室温放置1 min，将样品溶液转移至微量自动进样样品瓶中，加盖密封，置于55 ℃加热装置上加热10 min，冷却至室温后上机测定。

衍生试剂空白溶液：移取80 μL AccQ-Fluor硼酸盐缓冲液（Buffer 1）于6 mm×50 mm试管的底部，加入20 μL AccQ-Fluor衍生剂，立即涡旋混合，将样品溶液转移至微量自动进样样品瓶中，加盖密封，上机测定。

1.3.3 色谱条件

超高效液相色谱柱：AccQ-Tag Ultra C18（2.1 mm×100 mm，1.7 μm）；流动相：A为甲酸-甲酸铵缓冲溶液（20 mmol/L，pH 2.25），B为甲酸-甲酸铵缓冲溶液（20 mmol/L，pH 3.00），C为乙腈；进样体积1 μL；柱温55 ℃；检测波长260 nm，梯度洗脱程序如表1所示。

表1 梯度洗脱程序

注：A为甲酸-甲酸铵缓冲溶液（20 mmol/L，pH 2.25），B为甲酸-甲酸铵缓冲溶液（20 mmol/L，pH 3.00），C为乙腈。

1.4 数据处理

通过与仪器配套的Empower 3色谱数据处理系统完成数据采集与处理，以及Origin 8.0进行绘图。

相关链接：氨基酸，牛磺酸，2,4-二硝基氟苯，甲酸铵，谷氨酸，盐酸溶液，酪氨酸，北纳生物

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