食品中氟喹诺酮类药物残留的快速检测（一）

第三代含氟的喹诺酮药物——氟喹诺酮类药物（fluoroquinolones，FQs），通过抑制DNA回旋酶，破坏DNA的合成和复制，从而导致细菌死亡。由于其具有抗菌谱广、杀菌力强和价格低廉等特点，已然成为兽医的常用药物。但由于养殖和生产过程中一些不合理用药以及过量用药物问题的发生，残留的FQs通过食物链被人体摄入后，会对中枢神经系统和肝肾器官产生危害及毒性作用。对于食品中FQs的检测，传统的检测方法有液相色谱法、酶联免疫法、电化学分析法及微生物分析法等，但均存在操作繁琐、设备庞大和检测时间较长等缺点。因此，研发应用设备简便、灵敏度高的快速检测方法具有十分重要的意义。

荧光是物质被紫外线或X射线照射时发射出的各种颜色、不同强度的可见光。荧光分析法就是利用荧光强度及颜色变化进行定性和定量分析，是近十几年发展迅速的一种检测方法。它的特点是灵敏度较高且操作简单、响应时间短（由激发光照射后，几纳秒至几微秒即可发射可见光），正因为这些优点，使得荧光分析法在食品安全检测工作中被广泛应用且得到的很好的发展。如Wang Chongwen等设计了一种荧光定量分析试纸条，可在30 min内对食品中蛋白质毒素进行快速定量检测。

2020年Chen Jiamin等研发了一种基于铂纳米颗粒的荧光生物传感器，建立了快速检测水产品新鲜度敏感指标（次黄嘌呤）的荧光分析法。除此之外，荧光分析法同样被广泛地应用在生物医学领域、药物分析以及环境检测等工作中的痕量分析。若将荧光分析法应用于食品中FQs药物残留检测，可以简化操作、缩短检测时间、提高灵敏度及降低检测成本。本文综述近些年运用荧光法快速检测食品中FQs残留的研究进展以及部分FQs残留限量，旨在为食品中FQs残留检测提供参考。

1 部分氟喹诺酮类药物残留限量

我国政府对FQs残留的危害性十分重视，农业农村部公告第2292号规定“自2015年12月31日起，停止生产用于食品动物的洛美沙星（lomefloxacin，LOM）等4 种FQs兽药，同时撤销相关批准文号”。2019年9月6日发布的GB 31650—2019《食品安全国家标准食品中兽药最大残留限量》规定了达氟沙星（danofloxacin，DAN）等4 种FQs兽药在动物性食品中最大残留限量（maximum residue limit，MRL）。国际食品法典委员会（Codex Alimentarius Commission，CAC）为保障消费者健康制定了关于动物源性食品中FQs的MRL，在2009年，欧盟委员会发布了《食品中药物活性物质最大残留限量》（EU）No 37/2010号条例，同样制定了部分FQs在动物源性食品的限量标准，主要药物的名称和在食品中的MRL如表1所示。

表1 部分FQs在食品中MRL

注：ENR.恩诺沙星（enrofloxacin）；DIF.二氟沙星（difloxacin）；SAR.沙拉沙星（sarafloxacin）；NOR.诺氟沙星（norfloxacin）；CIP.环丙沙星（ciprofloxacin）；OFL.氧氟沙星（ofloxacin）；PEF.培氟沙星（pefloxacin）。

2 氟喹诺酮类药物残留荧光检测法

采用荧光分析法检测FQs，首先是对荧光材料的选择，荧光材料是荧光分析方法的重要基础。目前常用的荧光材料主要有有机荧光染料、纳米金、纳米银（Ag nanoparticles，AgNPs）、稀土发光纳米材料、量子点（quantum dots，QDs）等。稀土发光纳米材料分为上转换发光和下转化发光两种。上转换纳米颗粒（upconversion nanoparticles，UCNPs）发光是在近红外较低能量激发下，发射较高能量荧光，具有背景干扰小的优势。UCNPs通常由无机基质和掺杂稀土离子组成。QDs是半导体纳米材料，具有电致发光和光致发光的特性，包含金属QDs和碳QDs（carbon quantum dots，CDs）。金属QDs一般由IIB-VIA族或IIIA-VA族元素合成，如CdTe QDs、ZnSe QDs等。CDs相对其他荧光材料具有很强荧光可调性，且低毒、稳定性高，近年来受到广泛的关注和应用。如Ding Hui等[31]以L-谷氨酸和邻苯二胺为前体，通过改变反应溶剂并按适当的比例组合，合成了荧光发射从蓝色到近红外可调谐的CDs。

荧光分析的方法有很多，如直接的荧光增强和猝灭法、荧光免疫分析法、分子印迹聚合物（molecularly imprinted polymer，MIP）荧光检测法、荧光适配体传感器检测法、比率荧光和荧光比色分析法等。这些方法和技术的应用使荧光分析法朝着便捷、痕量以及智能的方向发展。

2.1 荧光增强检测法

荧光增强检测法是检测物通过给电子取代基与荧光物质形成共轭体系，产生共轭效应而引起荧光增强。荧光增强检测法可分为两种，一种是通过抑制光致电子转移（photoinduced electron transfer，PET）而使荧光增强，在PET体系中，电子供体通过间隔基与荧光团相连，PTE体系可导致荧光团猝灭，电子供体与检测物结合后，PET受到抑制，荧光恢复，如图1A所示。另外一种是分子内电荷转移（intramolecular charge transfer，ICT）使荧光团荧光增强，检测物通过配位或氢键的形成作用于荧光团的供电子基团（供体）或吸电子基团（受体），供体供电子能力或受体的吸电子能力越强，ICT效应越强，增强荧光发射（图1B）。

图1 荧光增强示意图

Hua Jianhao等利用CDs建立了FQs的荧光增强检测法。该方法以聚(4-苯乙烯磺酸-共聚-马来酸)为前体，通过水热法合成了硫掺杂CDs（sulfur-doped carbon quantum dots，S-CDs）作荧光探针并结合Fe3O4磁纳米粒子（magnetic nanoparticles，MNPs），MNPs独特的超顺磁性使它在外加磁场下快速富集，去除外部磁场后，立即在溶液中重新分散。基于S-CDs和NOR/CIP之间的强氢键相互作用和电荷转移，引起S-CDs荧光增强。通过外部磁铁作用，构建了CIP和NOR的吸附-洗脱-检测的荧光分析法。NOR和CIP的检测线性范围分别为0.02～1.25 μmol/L和0.02～1.0 μmol/L，检出限分别为4.6 nmol/L和6.7 nmol/L。

Kaur等采用化学共沉淀法合成了聚乙二醇包覆的Tb3＋掺杂的ZnS纳米粒子，用于NOR荧光检测。聚乙二醇包覆的Tb3＋掺杂的ZnS纳米粒子在波长334 nm的激发下，产生两个发射峰（490 nm和545 nm），分别对应于Tb3＋的5D4→7F6和5D4→7F5电子跃迁。随着NOR的加入，纳米粒子在545 nm波长处的荧光增强。以此来检测NOR残留量。

2.2 荧光猝灭与恢复检测法

荧光猝灭分析法是利用检测物和某一种荧光物质形成复合物或产生能量转移而产生猝灭作用，猝灭作用主要包括静态猝灭和动态猝灭，以及内滤效应（inner filter effect，IFE）等。图2A是荧光静态猝灭示意图，检测物和荧光物质分子发生络合反应，形成不发光的复合物。动态猝灭是检测物与荧光物质的激发态分子发生相互作用而引起的猝灭效应（图2B）。在IFE机制中，检测物（吸收体）的吸收与荧光团的发射带重叠，引起非辐射能量转移，导致荧光发射强度减小或猝灭。

图2 荧光猝灭示意图

Lu Wenjing等以邻苯二胺和4-氨基丁酸为前驱体并采用水热一步法合成了亮黄色荧光CDs。由于NOR和CDs之间的络合反应形成稳定的复合材料，导致静态荧光猝灭。并且观察到CDs-NOR猝灭的荧光可以通过引入组氨酸来恢复。CDs-FQs系统具有在“开启”模式下监测组氨酸水平的潜力。对实际样品牛奶中FQs残留分析表现出良好的检测性，NOR、CIP和OFL检测线性范围分别为0.05～150.00、0.2～2.0、0.4～10.0 μmol/L，NOR、CIP和OFL的检出限分别为17、35、67 nmol/L。

Guo Xingjia等以苹果酸和甘氨酸为原材料，采用水热法合成了棕色的CDs，当在368 nm激发波长下，CDs在452 nm发射蓝色荧光。并且Cu2＋存在下通过电子转移可猝灭CDs的荧光，而加入ENR后可以逐渐恢复。由于ENR对Cu2＋的结合亲和力高于CDs，二者形成了较大尺寸的配合物，CDs原始荧光才得以恢复。为此，设计了基于CDs-Cu2＋体系荧光恢复的快速灵敏荧光传感策略，用于ENR的选择性检测。

Qian Sihua等用溶剂热法制备了近红外（nearinfrared，NIR）-CDs，NIR-CDs显示出宽的激发带范围（200～600 nm），最佳的激发和发射波长分别在420 nm和680 nm处。对于FQs（以NOR为例）检测，随着NOR浓度增加，引起的NIR-CDs荧光强度下降是以IFE为基础的稳定猝灭机制所致。

2.3 荧光免疫分析法

荧光免疫分析法是利用抗体和抗原的特异性反应与荧光技术联结起来的一种检测方法。主要是通过荧光标记的抗体与抗原与结合，通过检测抗原抗体复合物的特异性荧光，最后根据荧光强度变化对检测物进行定性和定量分析。

Hu Gaoshuang等利用UCNPs作为信号探针，建立了动物源性食品中FQs的荧光免疫分析方法。该方法以包衣抗原修饰的聚苯乙烯颗粒为免疫探针，结合羧基功能化的抗NOR单克隆抗体，建立了UCNPs生物传感体系NaYF4∶YbEr作为荧光免疫信号探针（在542 nm波长处记录发射强度，在980 nm波长处激发）。以水产品（海鲈鱼、鱿鱼和虾）进行检测。NOR的检测限为10 pg/mL，检测线性范围在1×101～1×104 pg/mL。

Li Shijie等基于CDs/AgNPs建立了荧光免疫层析分析法，应用于ENR的特异性检测。采用水热合成法制备氮掺杂CDs（nitrogen-doped carbon quantum dots，N-CDs），并根据荧光共振能量转移原理构建了一个N-CDs-AgNPs-抗ENR多克隆抗体共轭物的猝灭体系。当ENR存在时，破坏了荧光共振能量体系，使N-CDs荧光得以恢复，且能够在30 min内通过简单的操作检测ENR，检测限为0.1 μg/L。

Kergaravat等将NOR的羧基通过活性酯法共价连接到牛血清白蛋白（bovine serum albumin，BSA）的赖氨酸基上。图3为在96 孔聚苯乙烯微孔板上建立的荧光免疫法检测FQs示意图。该方法是基于一种间接免疫竞争法，即样品中的FQs与固定在磁珠（magnetic bead，MB）上的FQs竞争抗FQs抗体，加入抗免疫球蛋白G抗体标记过氧化物酶及其底物（邻苯二胺），以邻苯二胺产物（2,3-二甲苯胺）的荧光强度为信号检测FQs，荧光信号与FQs浓度间接相关。ENR、CIP、DAN、OFL、SAR和NOR的检出限和定量限分别为13、10、13、30、29、22 μg/L和40、30、40、100、88、65 μg/L。

图3 荧光竞争免疫分析法检测FQs示意图

相关链接：氟喹诺酮，次黄嘌呤，二氟沙星，沙拉沙星，诺氟沙星，氧氟沙星，聚乙二醇，北纳生物

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