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食品中氟喹诺酮类药物残留的快速检测(二)

发布时间:2022-08-09 15:19 作者:北纳生物编辑-陈丹

2.4 分子印迹聚合物荧光检测法

分子印迹技术是模仿抗体抗原、酶与底物的特异性识别原理,将模板分子(检测物)先记忆,然后再洗脱,在印迹材料上形成特定的MIP,可以自然、选择性地识别检测物。MIP具有良好的识别性能,但是缺乏检测信号传输,将荧光物质通过聚合反应与MIP相结合,形成分子印迹荧光传感器,以荧光信号作检测分析(图4)。常见的分子印迹荧光传感器分为有机染料分子印迹荧光传感器、稀土分子印迹荧光传感器和QDs分子印迹荧光传感器。

Wu Chunxia等选择异硫氰酸荧光素(fluorescein isothiocyanate,FITC)有机染料作为荧光信号材料,在FITC改性二氧化硅纳米球表面合成MIP,以亲水性功能单体丙烯酰胺在荧光印迹纳米粒子上制备有效的CIP识别位点,采用多步沉淀法合成了MIPs@SiO2-FITC,激发波长为470 nm,发射波长为525 nm。荧光强度随着猝灭剂(CIP)浓度的增加而降低。制备的MIPs@SiO2-FITC具有良好的选择性,检出限是4.04 nmol/L。

Tang Yiwei等采用NaYF4∶Yb3+、Er3+ UCPs并结合MNPs,通过局域光聚合法制备了多功能MIP荧光探针。该方法在UCPs分散的正丙醇溶液中加入Fe3O4纳米粒子和正硅酸四乙酯,利用水解反应制备了磁性上转换发光纳米粒子。使MIP成为磁性富集、分子识别和上转换荧光的三元探针。


图4 MIP荧光检测法示意图

Shi Tian等以3-氨丙基三乙氧基硅烷为功能单体,聚乙二醇辛基苯基醚作为表面活性剂,NOR为分子模板,在硅烷化CdTe QDs表面合成了MIP。将模板分子洗脱后,得到与NOR分子的大小、形状和化学基团互补的特定三维印迹腔。NOR结合MIP-CdTe QDs后由于电子转移引起荧光猝灭,洗脱NOR后荧光再次出现,成功地制备了对NOR具有特异性的分子印迹荧光纳米探针。检出限为0.18 μmol/L。

2.5 荧光适配体传感器检测法

适配体是RNA寡核苷酸或DNA单链,它能特异性地与多种靶分子结合,如核酸、蛋白质、金属离子、抗生素以及细胞等,具有很高的亲和力、选择性和敏感性。适配体在与靶点结合前后具有明显不同的构象,以荧光团修饰适配体互补DNA链或直接修饰适配体,适配体和靶分子结合后可以影响荧光物质的荧光信号的变化,无论是增强还是减弱,都可以反映结合过程的程度,从而可以对目标物进行定性和定量检测,如图5所示。


图5 荧光适配体传感器检测FQs示意图[56]

Liu Xiuying等设计了一种基于适配体修饰的Fe3O4 MNPs与Yb、Er离子对掺杂UCNPs相结合的荧光适配体传感器。Fe3O4首先与具有适配体互补DNA链的UCNPs反应,在适配体与其互补DNA之间形成双链结构,生成杂交探针。因为探针在有ENR条件下优先与靶点结合,导致之前的部分双链结构解离后,杂交探针中的部分UCNPs被释放,荧光强度减弱,得到特异性好、灵敏度高的用于ENR测定的荧光适配体传感器。

2017年Liu Xiuying等又提出了一种新型的ENR荧光“双识别”检测方法。将生物素化ENR适配体固定在UCNPs表面,以捕获ENR作为识别的第一个保障。当适配体在已有靶标上正确折叠后,结合分子印迹技术与ENR剩余官能团相互作用是第二个保障。对鱼类样本检测表现出良好的检测性能。

Reinemann等采用荧光素标记寻找具有OFL特异性的适配体序列,并确定适配体-靶标体系的解离常数,经过8 轮的指数富集配体进化技术程序,获得了一个对几种FQs药物具有较高特异性的适配体。可以看出利用适配体、分子印迹技术以及免疫结合的特异性与高灵敏度的荧光分析法联用,能够进行识别性强,灵敏度高的分析检测,对于食品中FQs药物残留检测具有广阔的应用前景。

2.6 比率荧光检测法

只有一个荧光信号的产生可能有背景干扰的限制,基于比率的传感结构利用两个及以上不同波长荧光信号的比较(图6),然后计算其信号强度比,对FQs残留进行检测分析,能够更好地避免假阳性结果,进一步提升检测准确性。


图6 比率信号采集的示意图

Liu Xiqing等以桂花叶片为碳源,通过水热处理制备蓝色荧光CDs,采用溶胶-凝胶法与巯基乙酸修饰的红色CdTe QDs结合,随着CIP的加入,在657 nm波长处荧光逐渐猝灭,但在465 nm波长处左右,荧光强度逐渐增强,利用比率荧光选择性灵敏地测定CIP,检出限为0.012 7 nmol/L,线性范围为0~60 nmol/L。

Lu Changfang等以硒酵母为原料,通过水热法合成了CDs。它们进一步与核黄素偶联,形成双发射比率荧光探针,在370 nm激发波长下,探针显示双发射峰,峰值在443 nm和510 nm。当加入CIP时,由于CDs与CIP之间的氢键和共轭效应所致,在相同的激发条件下CDs的蓝色荧光增强。而核黄素的荧光(510 nm)强度保持不变。以荧光强度比率(I443 nm/I510 nm)反映CIP的浓度。检测限为0.13 μmol/L。

Gui Rijun等通过水热法制备了氨基功能化的CDs和羧基功能化硅QDs(Si quantum dots,SiDs)。CDs和SiDs通过碳二亚胺活化偶联反应结合形成CDs/SiDs共轭物。将共轭物用双(3-吡啶基甲基)胺(bis(3-pyridylmethyl)amine,BPMA)进行了功能化修饰,加入CuCl2溶液形成了CDs/SiDs-BPMA-Cu2+检测体系。在Cu2+存在下,Cu2+与CDs/SiDs-BPMA的表面配体有配位作用,引起SiDs荧光猝灭。而随着CIP的加入,Cu2+可以与CIP的C3-羧基和C4-酮基结合,产生一种新的Cu2+-CIP配合物,破坏了电子能量转移,荧光恢复。此外,Cu2+和CIP的加入不会影响红色荧光的CDs。以此建立了ISiDs/ICDs比率荧光检测法。

2.7 荧光比色分析法

荧光比色分析法是以荧光颜色变化为检测形式,通过裸眼或目测比色计进行观察,实现定性和定量分析,视觉画面的变化使人脑更容易更直接获取信息,达到可视化的实时现场荧光检测。荧光颜色变化分为颜色强度的变化和色调的变化,例如从暗红色到浅红色的变化,或者由黄绿色变成蓝色(图7)。


图7 荧光颜色随检测物浓度变化示意图

Ye Yingwang等报道了基于智能手机上QDs荧光比色分析法,通过将荧光信号转换为视觉颜色效果以实现对真实食品和环境样品中FQs的无标签现场检测。以黄绿色荧光的CdTe QDs匹配加替沙星(gatifloxacin,GFLX)的本征蓝色荧光,可在紫外光激发下形成双发射荧光信号,随着GFLX浓度的增加,通过PET,有效地触发在557 nm波长处黄绿色QDs的荧光猝灭,并伴随着448 nm波长处蓝色荧光强度显著增强。以QDs作为感应中心涂覆滤纸条,并嵌入到装有紫外灯的智能检测平台。一旦GFLX接触到感应中心,智能手机的内部摄像头启动图像捕获功能,以收集变化荧光颜色的实时图像。GFLX的检测线性范围在0.85~3.60 μmol/L,检出限为0.26 nmol/L,检测应答时间为5 min,可以看出该智能平台符合现场对食品中FQs残留快速检测的要求。

何伟杰利用红色荧光CDs和蓝色荧光SINPs构建了可视化荧光探针(CDs@SINPs),利用加入Cu2+发生电子转移,猝灭SINPs荧光,再加入CIP与Cu2+键和,抑制光电子转移,SINPs蓝色荧光恢复,探针出现了由红色向蓝色的变化。并制备了荧光测试纸条,在实际样品检测中,可以通过肉眼观察到测试纸的颜色变化,实现CIP的可视化检测。

3 结 语

FQs抗菌药物已经广泛应用于畜牧业和水产养殖业中细菌性疾病的预防和医治。但由于不规范用药问题的发生会导致药物残留,残留药物被人体摄入后会产生危害。我国农业农村部对FQs残留的危害性十分重视,并制定了残留限量标椎。对于FQs残留检测方面,荧光分析法相比传统的高效液相色谱、液相色谱-串联质谱技术和毛细管电泳法具有简单、快速、灵敏度高以及成本低等优势,是检测食品中FQs药物残留高效率方法。各类荧光分析法在食品中FQs检测的应用具有较低检出限,并可在几分钟至几十分钟的时间内完成快速检测。

简单的荧光增强与猝灭检测法稳定性和抗干扰性较差,不能适用复杂的食品环境基质,荧光免疫分析法、分子印迹荧光传感器以及荧光适配体传感器都具有很强的特异性识别功能,在成分复杂的食品中,能够识别目标,提高荧光检测法的特异性和选择性,适用于检测环境干扰因素较多的检测条件。而比率荧光法提供了一种自校准方法,绕过了仪器和环境因素,能够提升检测的稳定性。

荧光比色分析法作为可视化的检测方法,比以上的荧光检测法具备直观可视化的特点和优势。在检测环境不能满足相应设备仪器的条件下,用荧光比色试纸进行检测判断,采用肉眼辨别荧光颜色变化,作为对检测物的定性及半定量分析,可以达到高效率、低耗能的现场快速检测。但同样也存在荧光颜色变化是否明显,以及能否达到更低的检测限要求的问题和挑战,以荧光比色法研发可视化的智能检测平台和荧光比色试纸,将为现场实时快速检测食品中FQs药物残留开拓新的视野,是未来几年荧光分析检测的研究热点。

相关链接:3-吡啶基甲基核黄素硒酵母二氧化硅正丙醇溶液正硅酸四乙酯核酸北纳生物

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