诺如病毒（norovirus，NoV）为正向单链RNA病毒，分为5 个基因型（GI～GV），大多数感染人类的NoV属于GI型和GII型，引起腹泻呕吐等急性症状，严重可致死亡。NoV主要通过污染食品进行传播，食品中含有微量NoV即可引起感染。因此需要建立科学、高效的食品中NoV检测手段，控制NoV引起的疾病，保障人民健康。

数字聚合酶链式反应（polymerase chain reaction，PCR）技术通过将反应体系无限稀释，可使PCR扩增的荧光信号由指数形式转换为数字信号，检测灵敏度提高到单分子水平。目前，微滴式数字PCR平台中的逆转录微滴式聚合酶链式反应（reverse transcriptase droplet digital polymerase chain reaction，RT-ddPCR）无需单独进行逆转录反应，直接定量RNA，可作为食品中NoV定量检测的有效技术手段。

食品中NoV定量需要病毒浓缩、核酸提取纯化等前处理过程，但此过程中病毒回收率未知，故RT-ddPCR定量结果不等于食品中NoV实际载量。需要建立简便操作性强的过程控制程序，指示NoV回收率，换算食品中NoV实际载量。MS2噬菌体是一种无包膜+ssRNA病毒，大小和结构与NoV比较接近，可作为过程控制模式病毒添加到食品样品中。本研究拟以RT-ddPCR检测体系为基础，建立NoV定量检测方法，探索MS2噬菌体的过程控制程序，构建基于RT-ddPCR技术的食品中NoV定量检测方法。

1 材料与方法

1.1 材料、试剂与仪器

牡蛎、苹果、羽叶生菜和草莓 市购。

GI、GII型NoV、星状病毒（humanastrovirus，HastV）、甲肝病毒（hepatitis A virus，HAV）、轮状病毒（rotavirus，RV）RNA，MS2噬菌体悬液（效价7.2×1011 PFU/mL），本实验室保存；GI型NoV RNA标准物质（特性值（5.4±1.2）×107 拷贝/μL）和GII型NoV RNA标准物质（特性值（5.9±1.2）×104 拷贝/μL），本实验室研制保存；GII型NoV阳性粪便样品，由北京儿童医院赠送。

焦碳酸二乙酯（diethyl paracanbonate，DEPC）处理水、蛋白酶K 天根生化科技（北京）有限公司；总RNA提取试剂Trizol、SuperScript III Platinum One-Step Quantitative RT-PCR system 美国英杰生命技术有限公司；无水乙醇、异丙醇、氯仿 国药集团化学试剂北京有限公司；QIAamp Virial RNA Mini Kit 德国QIAGEN公司；Dynadbeads mRNA Purification Kit 美国Life Technology公司；One-Step RT-ddPCR Advanced Kit for Probes 美国伯乐公司。

热循环仪、实时荧光PCR仪 美国应用生物系统公司；QX-200数字PCR系统、微滴生成仪 美国伯乐公司；微定量核酸蛋白分析仪 美国赛默飞世尔科技公司。

1.2 方法

1.2.1 引物探针设计和筛选

根据NoV基因型分型保守区域：编码RNA依赖的RNA聚合酶（RNA dependent RNA polymerase，RdRp）区域和开放阅读框2（Open Reading Frame 2，ORF2）编码主要结构蛋白VP1区域，通过NCBI在线工具进行序列分析和比对，利用Prime Express软件V4.0（ABI,Foster City,CA,USA）分别设计GI型和GII型NoV引物和探针；对于MS2噬菌体，选取Dreier等设计的引物和探针，通过NCBI在线工具BLAST进行序列分析和比对，确定目的片段同源性。分别取实验室保存的GI、GII型NoV RNA和提取的MS2噬菌体RNA为模板，首先采用荧光PCR方法对设计的引物探针进行筛选和特异性验证，再采用RT-ddPCR体系进一步验证筛选的引物探针的特异性。反应参数：荧光PCR：50 ℃反转录15 min，95 ℃热启动2 min，95 ℃变性15 s、60 ℃退火延伸1 min、40 个循环；RT-ddPCR：参照One-Step RT-ddPCR Advanced Kit for Probes试剂盒说明书配制反应体系，60 ℃反转录60 min，95 ℃热启动10 min，95 ℃变性30 s、60 ℃退火延伸1 min、40 个循环，98 ℃酶失活10 min，4 ℃保持，升降温速率2～3 ℃/s。

1.2.2 RT-ddPCR体系扩增温度优化

分别以实验室保存的GI、GII型NoV RNA和提取的MS2噬菌体RNA为模板，按One-Step RT-ddPCR Advanced Kit for Probes试剂盒说明书，分别在不同退火温度下进行扩增反应，以阳性微滴扩增强度为标准，对筛选出的引物探针退火温度进行优化。

1.2.3 GI、GII型NoV和MS2噬菌体RT-ddPCR定量检测方法学评估

1.2.3.1 3 个RT-ddPCR定量检测方法的定量限和准确性分析

MS2噬菌体核酸拷贝浓度测定：取MS2噬菌体悬液100 μL，提取RNA后溶于100 μL DEPC水，应用微定量核酸蛋白分析仪测定其OD260nm、OD260nm/OD280nm及核酸质量浓度值，重复测定5 次，取平均值作为提取的RNA核酸质量浓度值。计算提取的MS2噬菌体核酸拷贝浓度，公式如下：

将保存的GI、GII型NoV RNA标准物质和提取的MS2噬菌体RNA分别按多倍梯度稀释，每个梯度各取2 μL，分别进行RT-ddPCR检测，每个梯度重复检测4 次，计算相对标准偏差（relative standard deviation，RSD），分别确定3 个RT-ddPCR定量检测方法的定量限，分析检测值与理论值之间的关系，确定检测体系的准确性。

1.2.3.2 3 个RT-ddPCR定量检测方法的重复性分析

分别取GI、GII型NoV RNA标准物质和提取的MS2噬菌体RNA为模板，按10 倍梯度稀释，各取高、低两个梯度进行相应的RT-ddPCR检测，每个梯度各取2 μL。每种模板分别各取3 个平行进行稀释，每个平行每个梯度重复检测6 次，同时设置1 个空白对照（DEPC水）。计算各样品各梯度的检测值与其理论值的偏差，分析检测方法的重复性。

1.2.4 实际样品中添加MS2噬菌体对NoV定量检测结果的影响分析

由于CEN ISO/TS 15216-2:2019中不同食品基质的前处理方法不同，选择贝类（牡蛎）、硬质表面食品（苹果）、生食蔬菜（羽叶生菜）以及软质水果（草莓）4 种食品基质用于制备阳性样品。根据CEN ISO/TS 15216-2:2019中不同食品基质的检测用量[11-12]，分别向牡蛎消化腺2 g、苹果（带皮）表面100 cm2、羽叶生菜25 g和草莓25 g样品中添加100 μL实验室保存的NoV阳性粪便样品（GII型NoV），静置30 min，每种基质制备两份平行阳性样品。制备的阳性样品（包括牡蛎消化腺2 g、苹果（带皮）表面100 cm2、羽叶生菜25 g和草莓25 g）全部用于RT-ddPCR定量检测。各阳性样品参照CEN ISO/TS 15216-2:2019中不同不同食品基质的前处理方法进行病毒洗脱和浓缩，其中一份阳性样品在前处理过程中添加100 μL MS2噬菌体悬液，另一份平行的阳性样品不添加MS2噬菌体悬液。病毒洗脱和浓缩后，提取RNA溶于100 μL DEPC处理水中。将提取的阳性样本RNA分别进行GII型NoV和MS2噬菌体RT-ddPCR定量检测，每份样品重复检测6 次，分析添加MS2噬菌体对阳性样品中NoV定量检测结果的影响。

1.2.5 基于RT-ddPCR技术的食品中NoV定量检测方法的实际应用

从超市或市场购入贝类样品23 份、硬表面食品8 份、生食蔬菜9 份、软质水果15 份，共计55 份样品。硬表面食品和生食蔬菜购入后立即进行检测或保存于4 ℃，贝类和软质水果可立即进行检测，或者保存于-80 ℃。参考CEN ISO/TS 15216-2:2019中对不同食品基质的检测用量的规定，分别取贝类消化腺2 g、硬表面食品表面积100 cm2、生食蔬菜25 g、软质水果25 g，采用基于RT-ddPCR技术的食品中NoV定量检测方法进行NoV筛查和定量检测，且每份实际样品在检测前，均添加100 μL实验室保存的MS2噬菌体悬液作为过程质控，分析不同食品基质中MS2噬菌体的回收率，并计算阳性样品中NoV实际载量。

1.3 统计分析

采用SPSS 17.0统计软件分析各组之间的差别，统计方法采用t检验和单因素方差分析，检验水平α=0.05。

相关链接：诺如病毒，甲肝病毒，轮状病毒，噬菌体，蛋白酶K，无水乙醇，异丙醇，北纳生物

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