六、稀释液

pH7.0氯化钠-蛋白胨缓冲液。

七、冲洗液

0.1%蛋白胨水溶液（按2010年版《中国药典》规定方法配制）。

八、菌液制备

接种枯草芽胞杆菌、金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌新鲜培养物至营养肉汤培养基中；接种生孢梭菌的新鲜培养物至硫乙醇酸盐流体培养基中，3℃±2℃培养18--24h；接种白色念珠菌至改良马丁培养基中，25℃±2℃培养24--48h；接种黑曲霉菌的新鲜培养物至改良马丁琼脂斜面培养基，23℃-28℃，培养5--7d，使大量的孢子成熟，加入3-5ml含0.05%（ml/ml）聚山梨酯80的0.9%的无菌氯化钠溶液，用玻棒或白金饵轻轻振摇将孢子洗脱，然后用管底带有能过滤菌丝装置（如薄层无菌棉花或纱布的毛细吸管）的吸管吸出孢子悬液至无菌试管内。用含0.05%（ml/ml）聚山梨酯80的0.9%无菌氯化钠溶液制成每毫升含菌10--10菌落形成单位（CFU）的孢子悬液。进行菌数测定。

九、供试液制备

取规定供试品3瓶，按无菌操作方法处理，薄膜过滤法进行验证。

十、验证方法

（一）供试品管

样品溶解于pH7.0氯化钠-蛋白胨缓冲液10ml中，取50ml溶解后的样品，使用泰林一次性集菌器KDGB20按薄膜过滤法过滤，用冲洗液冲洗（冲洗量每管50ml，每次10ml），每次振摇，使可能附在培养器壁上的抑菌成分尽量冲掉，于最后一次冲洗液中加入小于10CFU的试验菌过滤，加入硫乙醇酸盐培养基或改良马丁培养基至滤筒内。置规定温度培养3--5d（表6-9）。

（二）对照管

将该培养器余下的另一管同供试品管冲洗，往最后一次冲洗液中加入与供试品管同量的试验菌过滤，加入硫乙醇酸盐培养基或改良马丁培养基至滤筒内。其中硫乙醇酸盐培养基置30℃--35℃、改良马丁培养基置23℃--28℃培养3--5d（表6-9）。各试验菌逐一同法操作。

十一、供试品的无菌检测

取样品6瓶，溶解于pH7.0氯化钠-蛋白胨缓冲液20ml中，取10ml溶解后的样品，使用泰林一次性集菌器KDGB20按薄膜过滤法全部过滤，然后用冲洗液冲洗（冲洗量每管50ml，每次10ml），振摇，分别将硫乙醇酸盐培养基或改良马丁培养基加至滤筒内。置规定温度培养14d。取相应溶剂、稀释液及冲洗液同法操作，作为阴性对照。阴性对照不得有菌生长。

十二、试验结果

试验结果表明，与对照管比较，含供试品各试验管试验菌均生长良好，方法验证试验通过。

十三、验证结论

本品按2010年版《中国药典》二部附录中无菌检测方法学验证要求进行验证，结果可采用薄膜过滤法（取样品9瓶，溶于pH7.0氯化钠-蛋白胨缓冲液20ml中，取10ml溶解后的样品，使用泰林一次性集菌器KDGB20，冲洗量每管50ml，冲洗每次10ml）对本品进行无菌检测。