原标题：光致活性氧淬灭方法检测生物抗氧化剂动力学模型分析

摘 要： 以 TiO ₂ 纳米颗粒光催化反应为模型,研究了反应过程中的活性氧(ROS)产生以及活性氧淬灭的反应动力学模型。 对苯二甲酸分子与体系中的光催化反应产生的 OH· 反应, 生成具有荧光性质的 2-羟基对苯二甲酸(λ _ex =315 nm,λ _em =425 nm),因此对苯二甲酸作为氧化探针分子与体系中的生物抗氧化剂(AOs)分子竞争与 ROS 的反应,根据体系的荧光、反应时间以及 AOs 的浓度建立了 AOs 淬灭 ROS 的反应动力学模型。根据此模型推导 AOs 清除 ROS 的动力学常数,发现常见的生物抗氧化剂的抗氧化活性大小顺序为:硫辛酸、没食子酸、谷胱甘肽、尿酸、维生素 C、维生素 E、水溶性维生素 E 和胆红素。

1. 引 言

在生命科学、食品科学以及临床医学等领域,生物分子的氧化过程以及生物抗氧化剂(AOs)的作用是研究较为广泛的课题。 氧分子在线粒体中的呼吸链反应过程提供生物系统的主要能源,并且对细胞的生存至关重要。 在这些代谢过程中产生的活性氧(ROS)和其它自由基可能导致人体内的氧化损害。 抗氧化保护系统包括内源保护酶(例如超氧化物歧化酶、过氧化氢酶和过氧化物酶)、内源性AOs 分子(例如谷胱甘肽)或外源性AOs 物质(例如维生素 C、E)。 当人体内产生的自由基或 ROS 的量超过 AOs,这些过剩的氧化物质就会破坏生物组织以及细胞功能。 因此,研究人体氧化应激状态以及生物抗氧化剂的作用具有重要意义。

根据相关的反应机理,AOs 可以被氢原子受体(例如超氧自由基)或电子受体(例如 Fe ³⁺ )氧化。 文献提出了各种自由基反应的方法研究AOs 的抗氧化特性,其中使用的自由基通过加热引发产生,通过吸光度或荧光强度分析 AOs 的抗氧化性能。 这些方法包括总自由基捕获抗氧化参数方法(TRAP)、氧自由基吸收能力方法(ORAC)、2,2-二苯基-1-苦基肼(DPPH)自由基清除方法。 这些方法使用自由基引发剂和 UV 或荧光分子探针以监测反应动力学过程,得到相应的抗氧化反应动力学参数,UV 或荧光分子探针的浓度通常小于 AOs 浓度。 另外,应用较多的还有维生素 E等效总抗氧化能力方法(TEAC)、Fe ³⁺ 还原抗氧化能力方法(FRAP)。

文献相继报道了 OH· 淬灭、H ₂ O ₂、H ₂ O ₂和 OH· 混合淬灭等电化学传感器检测 AOs 的方法,并推导了不同的反应动力学模型。 最近,Ma 等相继开发了光催化 ROS 物种(包括正电空穴和自由基)淬灭检测 AOs 的光电流电化学传感器方法。 在此基础上,本研究尝试建立AOs淬灭光催化产生氧化物质检测方法的反应动力学模型。

生物学研究中,OH· 是当H ₂ O ₂与 Fe髤的反应(Fenton 反应)产生的。 然而,在 ROS 淬灭检测AOs 的方法中使用的 Fenton 反应混合物产生 ROS 存在一些问题,如 AOs 与 Fe髤螯合,从而改变相应金属螯合剂的活性;AOs 在高浓度下会起到促氧化剂作用产生更多 ROS 。 这些因素使 AOs 清除 ROS能力的反应机理很复杂。 相比之下,在 AOs 研究中使用纳米 TiO ₂ 光催化解离水是一个清洁、简单的连续产生 OH· 的方法。 具体反应过程如下:

TiO ₂ 纳米结构材料在太阳能光电转换、水分解以及环境净化等领域得到广泛应用。 TiO ₂ 的电子结构包括价带(VB)和导带(CB),两者之间的带隙(E _g )为 3. 2 eV。 当吸收一个光子的能量与E _g 相匹配时,电子激发从 VB 进入 CB,VB 中形成空穴。 在溶液中电子供体和受体同时存在时,抑制电子和空穴之间的重组反应。 如图 1 所示, TiO ₂ 在纯水中光解,水分子溶剂化的纳米颗粒和溶解的氧气可以与空穴和电子分别反应生成 OH· 。 TiO ₂ 的这种光催化反应已经运用到基于双链 DNA 修饰的 TiO ₂电极的电化学抗氧化剂传感器上。 DNA 吸附于沉积在ITO电极的 TiO ₂ 涂层上, 在紫外光照射下,所产生的 OH· 氧化破坏吸附的 DNA。

本研究提出了一个以对苯二甲酸(TA)为氧化探针,基于 TA 与 AOs 竞争 TiO ₂ 光催化产生氧化物质反应的动力学模型,其中反应过程中形成的具有荧光活性的  2-羟基对苯二甲酸(HTA)作为荧光探针,标定 AOs 的抗氧化动力学性质。

2. 实验部分

2.1 仪器与试剂

HTA 的荧光光谱(由 TA 的与羟基自由基反应产生)测定采用 Perkin-Elmer LS-50B 荧光光谱仪(美国 PerkinElmer 公司)。 一定浓度的 AOs 溶液与 25 μg/ mL TiO ₂ 、0. 1 mmol/ L TA 混合,在 UV 灯(波长360 nm)照射一定时间后,测量荧光, 激发波长(λ_ex )为 315 nm,发射波长(λ _em )为 425 nm。

PBS 缓冲溶液(pH 7. 4)由 50 mmol/ L 磷酸盐(Na ₂ HPO ₄ / NaH ₂ PO ₄ )和 10 mmol/ L NaCl 组成。 使用的 AOs 包括谷胱甘肽(GSH,Sigma)、没食子酸(GA,Acros)、维生素 C(Vc, Riedel-deHaen)、尿酸(UA,Fluka)、trolox(Fluka)、胆红素(Fluka)、硫辛酸(Degussa)均溶解于 PBS 缓冲液, 维生素 E(Ve,DL-α-to-copherolacetate, Sigma)溶解在 0. 1%Triton X -100 中,AOs 储备液浓度均为 10 mmol/ L。 TiO ₂ 纳米颗粒(Degussa, P25)直径为 21nm,比表面积 50 m 2 / g,充分研磨后分散在水中(0. 5 mg/ mL)。 TA(Fluka)溶解在 2 mmol/ L NaOH 溶液中,浓度为 1 mmol/ L。

2.2 荧光寿命测试

荧光寿命衰减测量采用时间相关单光子计数(TCSPC)技术。 飞秒激光脉冲从锁模钛宝石激光器(Spectra Physics, Tsunami,美国); Nd ： YVO4 泵浦固体激光器(Spectra Physics, MillenniaXs,美国),被定向到一个脉冲拾取器和倍频器(Spectra Physics,model 3980,美国)。 重复频率设定为 400 kHz。 激发光束是使用偏振器产生的 s-偏振光。 该荧光通过透镜聚焦放置在90^。角从激发光束到单色器(JobinYvon, H-10,法国)的入口狭缝,检测由一个冷却微通道板式光电倍增管(MCP-PM, Hamamatsu,R3809U-50, 日本)进行。 MCP-PM 壳体的温度设定为-20℃,降低暗电流。 在 MCP-PM 的输出后用放大器(Becker & Hickl GmbH,英国) 进一步放大,并通过一个单光子计数模块(Edinburgh Instruments,TCC900,英国)分析。 恒定比例辨识器(CFD)的参数通过 T900 软件获得优化的标准分子的荧光寿命。Ludox 激发光通过样品池并记录散射光,得到仪器响应最大半宽值约为90ps。整个过程荧光检测波长为 425 nm。 荧光光子的数量相对向起动脉冲的光子数量保持在较低的水平(1%或更少)。

来源：北京标准物质网