探究春夏茶之间儿茶素类生物合成基因之间的相关性（一）

黄酮类化合物广泛存在于自然界的植物中，属植物次生代谢产物。黄酮类化合物是以黄酮(2-苯基色原酮)为母核而衍生的一类黄色色素，其中包括黄酮的同分异构体及其氢化和还原产物，也即以C₆一C₃一C₆为基本碳架的一系列化合物。黄酮类化合物在植物界分布很广，在植物体内大部分与糖结合成苷类或碳糖基的形式存在，也有的以游离形式存在。类黄酮是植物体内主要的次生代谢产物，具有重要的生理作用，如调节生长素的运输、紫外线防护、帮助植物防御病原体和抵抗不良环境等，茶树体内丰富的儿茶素类属于类黄酮类物质，儿茶素类在茶树体内的分布和积累受到多方面的调控，不同发育阶段儿茶素类的含量存在差异且不同器官中呈现不同的变化规律；光质和光强影响儿茶素类的合成，遮光条件下儿茶素类含量下降；不同茶树品种儿茶素类含量也具有较高的变异性。苯丙烷生物合成途径是植物中最典型的次生代谢途径之一，儿茶素类是苯丙烷生物合成途径的衍生物。

如图1所示，苯丙氨酸在苯丙氨酸解氨酶的作用下脱氨生成反式肉桂酸，反式肉桂酸通过肉桂酸羟化酶催化的氧化反应转化成对香豆酸，4-香豆酸CoA连接酶激活硫酯化反应将对香豆酸转化成香豆酰CoA，然后进入类黄酮生物合成途径生成非酯型儿茶素。查耳酮合成酶可以催化香豆酰CoA和丙二酰CoA转变成查耳酮，查耳酮在查耳酮异构酶的催化下C环闭合异构化形成黄烷酮，黄烷酮在黄烷酮3-羟化酶、类黄酮3′-羟化酶以及类黄酮3′,5′-羟化酶的催化下发生羟基化反应形成二氢黄酮醇，二氢黄酮醇4-还原酶可将二氢黄酮醇还原成无色花青素，无色花青素在无色花色素还原酶、花青素合成酶以及花青素还原酶的作用下形成非酯型儿茶素，进一步形成酯型儿茶素。

茶树酯型儿茶素的没食子酰基化合成途径涉及两步反应，第1步为没食子酰基的活化，即葡萄糖基转移酶（UDP-glucose:galloyl-1-O-β-D-glucosyltransferase，UGGT）催化没食子酸（gallic acid，GA）和尿苷二磷酸葡萄糖（UDP-glucose，UDPG）形成没食子酰基葡萄糖，第2步是没食子酰基的转移，没食子酰基葡萄糖和2,3-顺式黄烷-3-醇在表儿茶素没食子酰基-葡萄糖-O-没食子酰基转移酶（epicatechin:1-O-galloyl-β-D-glucose-O-galloyltransferase，ECGT）的作用下形成酯型儿茶素。

图 儿茶素生物合成途径

儿茶素（catechin，C）；表儿茶素（epicatechin，EC）；表没食子儿茶素（epigallocatechin，EGC）；表没食子儿茶素没食子酸酯（epigallocatechin gallate，EGCG）；没食子儿茶素没食子酸酯（gallocatechin gallate，GCG）；表儿茶素没食子酸酯（epivcatechin gallate，ECG）。

儿茶素类生物合成酶编码基因的相对表达量在不同嫩度的茶树鲜叶以及茶树不同组织中的表达差异受到了广泛的关注，白化茶树叶片发育不同时期儿茶素类水平及相关基因表达的变化也有报道，Liu Min等研究了春秋季不同茶树品种的儿茶素类含量与调控儿茶素合成酶基因表达的相关性，但是春夏季茶树品种儿茶素生物合成相关基因表达的差异尚鲜见报道。福鼎大白茶、槠叶齐为国家级良种，在全国范围内推广面积大，品质稳定，碧香早与白毫早为湖南省主栽茶树品种，茶树生长速度快、适应性较强，因此本研究选取福鼎大白茶、白毫早、碧香早、槠叶齐茶树品种为原料，研究春夏季茶树体内儿茶素类含量以及儿茶素类生物合成基因表达的差异，旨在探究春茶和夏茶之间儿茶素类含量与生物合成基因之间的相关性。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

福鼎大白茶、白毫早、碧香早、槠叶齐茶树鲜叶，采摘时间为2020年3月28日和7月24日，采摘标准为一芽二叶，采摘地点为湖南省茶叶研究所高桥实验茶场。鲜叶采摘后迅速用液氮冷冻，-80 ℃保存备用。

N,N-二甲基甲酰胺（色谱纯） 天津市化学试剂研究所；冰醋酸（色谱纯）、甲醇（色谱纯）、碳酸钠、福林-酚试剂 国药集团化学试剂有限公司；GA标准品（90.34%）、儿茶素标准品、可可碱标准品（95%）、茶碱标准品（99%） 美国Sigma公司；RNAprep Pure植物总RNA提取试剂盒 天根生化科技有限公司；PrimeScriptTM RT Master Mix（TaKaRa）、TB Green® Premix Ex Taq™ II（TaKaRa） 上海百赛生物技术股份有限公司。

1.2 仪器与设备

真空冷冻干燥仪 美国热电公司；LC-2010AHT高效液相色谱仪、UV-2250紫外分光光度计 日本岛津公司； MS204TS/00型电子分析天平 美国Mettler Toledo公司； DSY-2-8水浴锅 常州国华有限公司；低速离心机 北京雷勃尔离心机有限公司；QuantStudioTM 3荧光定量聚合酶链式反应（polymerase chain reaction，PCR）仪、Nanodrop 2000/2000c核酸浓度测定仪 赛默飞世尔科技公司。

1.3 方法

1.3.1 儿茶素组分以及茶多酚含量的测定

茶树鲜叶真空冷冻干燥后用研磨机研磨成粉末，用于提取茶汤，茶多酚的测定参照GB/T 8313—2018《茶叶中茶多酚和儿茶素类含量的检测方法》，测定儿茶素组分的茶汤采用水提，即称取0.6 g茶粉（准确至0.000 1 g）于100 mL锥形瓶中，加入90 mL沸蒸馏水后立即移入沸水浴中，浸提45 min（每隔10 min摇动一次），浸提完毕后趁热过滤，冷却后定容至100 mL，茶汤过0.45 μm滤膜后，采用高效液相色谱方法测定儿茶素组分，色谱程序参照文献。

1.3.2 RNA提取和cDNA的合成

样品总RNA提取采用RNAprep pure植物总RNA提取试剂盒（TIANGEN），RNA浓度的测定通过Nanodrop 2000/2000核酸浓度测定仪，并通过琼脂糖凝胶电泳检测RNA质量。采用PrimeScriptTM RT reagent Kit （TaKaRa）合成cDNA并于-20 ℃保存待用。实时聚合酶链式反应（real-time polymerase chain reaction，real-time PCR）分析采用TB Green® Premix Ex TaqTM II（Tli RNaseH Plus）试剂盒（TaKaRa），每个样品重复3 次。所用引物参照已发表的文献，内参基因为GAPDH，序列如表1所示。

表1 real-time PCR引物序列

1.4 数据处理与分析

数据用GraphPad Prism 8作图，基因的相对表达量采用2-ΔΔCt法计算，SPSS 25.0分析数据，春夏季儿茶素组分、茶多酚含量以及基因相对表达量比较运用t检验，不同品种茶树鲜叶基因表达量的差异采用单因素方差分析，根据Duncan新复极差法进行多重比较，Pearson相关系数作相关性分析。

相关链接：儿茶素，苯丙氨酸，二氢黄酮醇，类黄酮，花青素，对香豆酸，没食子儿茶素没食子酸酯，北纳生物

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