蛋黄蛋白肽纳米颗粒对姜黄素的包埋与递送特性

姜黄素（Cur）是一种主要存在于姜黄属植物根茎中的天然二酮类化合物，具有多种生理功能，被广泛用于功能性食品的开发。Cur的溶解性较差，很难被小肠上皮细胞直接吸收，且其疏水性会导致其被外排系统排出，难以发挥应有的药理效应。由于蛋白基纳米颗粒无毒、可生物降解以及良好的生物相容性，被公认为是一种理想的递送系统。蛋黄富含蛋白质和磷脂等活性物质，具有优良的油-水界面吸附能力和乳状液的抗聚结能力，促使其广泛应用于蛋黄酱、沙拉酱和烘焙食品中。工业萃取脱磷脂和蛋黄油之后剩下的脱脂蛋黄粉蛋白含量较高，质量分数在50%～80%之间，但功能性质极差，几乎不溶于水，无法直接应用于食品工业。

近日，华南理工大学食品科学与工程学院的在前期研究基础上，本研究继续利用胰蛋白酶水解脱脂蛋黄粉，得到的两亲性EYP在水相中可通过疏水相互作用自组装成EYP胶束状纳米颗粒（EYPNs），通过调节pH值控制EYPNs的自组装行为，进而构建EYPNs复合Cur纳米颗粒输送体系，以期扩大脱脂蛋黄粉在功能性纳米胶体领域的应用范围。

1 EYPNs-Cur的结构表征

通过pH值诱导共组装的方法自下而上制备EYPNs-Cur，制备工艺环保、简单，未使用有机溶剂，且无需复杂的分离过程。通过将EYPNs溶液pH值调至12.0，促使EYPNs解离并使Cur实现足够程度的质子化，增加其溶解度，再将pH值回调至7.0，诱导EYPNs重新自组装形成胶束，从而封装Cur。随着EYPNs添加量的增加，溶液颜色逐渐变深，表明Cur被包封的量不断提高。在中性水溶液中，Cur的溶解度很低，经测定仅为0.13 μg/mL，EYPNs具有较强增溶Cur的能力，当EYPNs质量分数为0.5%时，Cur溶解度（50 μg/mL）明显提升。随着EYPNs质量分数的进一步增加（0.5%～4.0%），Cur的包埋率和溶解度不断升高；当EYPNs质量分数为4.0%时，Cur溶解度（434.35 μg/mL）与对照样相比提高了3 339 倍，且溶液呈均一、分散状态。一般而言，较小的粒径和绝对值较高的Zeta电位意味胶体稳定性较高。水中游离的Cur粒径呈双峰分布，粒径分别为几百纳米到几微米，这表明Cur在水中的存在形式为不均匀的聚集体；并且Cur的Zeta电位仅为－6.9 mV，说明游离Cur在水相中极不稳定。而EYPNs-Cur的粒径分布均为单峰，平均粒径为106.9～126.0 nm，Zeta电位为－20 mV左右。综上，通过EYPNs自组装形成的EYPNs-Cur具有优异的溶解度和胶体分散性。

游离Cur聚集成大的片状结构，这是由于游离的Cur在水中几乎不溶解，以聚集体形式存在；EYPNs-Cur呈球状结构，平均粒径约为120 nm，和纳米粒度仪测定结果基本一致，但也出现了少量不规则聚集，造成粒径变大，很有可能是由于自然风干过程引发EYPNs-Cur出现轻微的聚集。AFM显示出类似的结果，在游离Cur中观察到大量微米级聚集体，这也是游离Cur粒径测定时出现双峰的原因，EYPNs-Cur复合物则呈类似于球形的纳米结构且分布相对均匀。

冻干后的样品FE-SEM图像，游离Cur冻干后进一步聚集，形成较为致密的蜂窝状结构，出现大量不规则棒块状颗粒，EYPNs-Cur冻干后结构相对松散，能观察到大量球状纳米颗粒，同时有大块片状结构出现，可能是由于冷冻干燥过程造成部分纳米颗粒结构的改变。

2 EYPNs和Cur的相互作用分析

蛋白质的内源荧光光谱法是研究水溶液中蛋白质与小分子结合情况的一种方便的方法。不同Cur添加量对EYPNs发射光谱的影响。不添加Cur的纯EYPNs溶液中，在280 nm波长处被激发后，在350 nm波长处出现了一个较高强度的荧光光谱峰。加入少量Cur（10 μg/mL）后，EYPNs的荧光强度即出现大幅减弱，随着Cur质量浓度（10～40 μg/mL）的进一步增加，EYPNs的荧光强度逐渐减弱并逐渐猝灭，最大发射波长变化不大，这说明Cur分子通过疏水相互作用与EYPNs结合，但对于其所处的微环境无明显影响。Cur诱导EYPNs的荧光猝灭属于静态猝灭。

XRD被广泛应用于活性物质包埋体系或生物聚合物结晶度的研究。由游离Cur是高度结晶结构，EYPNs为无定形结构。经过简单的物理混合后，Cur的结晶峰强度有所减弱，但是大部分衍射峰并没有消失，这可能是由于EYPNs会掩盖部分Cur造成其衍射峰强度降低；EYPNs-Cur的XRD光谱未显示任何衍射峰，与EYPNs几乎完全一致，表明Cur被EYPNs完全封装。游离Cur在3 510 cm－1处出现的特征吸收峰，对应于Cur中酚羟基（—OH）的拉伸振动。物理混合后Cur的多处特征峰（3 510、1 628、870、710 cm－1）有所减弱但是并没有消失，这可能是因为EYPNs具有较高的峰形，会掩盖部分Cur的指纹区使其特征峰强度降低，这表明物理混合并不会使EYPNs与Cur发生相互作用。EYPNs-Cur在3 510 cm－1处的—OH拉伸振动峰消失，说明Cur和EYPNs之间可能存在氢键相互作用。Cur分子在1 427、1 154 cm－1和855 cm－1处的特征峰主要与芳香环和环间链的振动有关，Cur指纹图谱区域（500～1 300 cm－1）吸收峰的强度和数量在EYPNs-Cur中均出现明显降低，表明Cur的疏水基团可能通过疏水相互作用与蛋白质相互作用。此外，Cur-EYPNs与EYPNs的峰形完全一致，这表明Cur与EYPNs通过非共价相互作用结合后完全被封装起来。

3 EYPNs-Cur的储存稳定性

在25 ℃下贮藏1 个月的过程中，EYPNs质量分数为0.5%和1.0%时，EYPNs-Curs的粒径基本不变，2.0%和3.0% EYPNs组的粒径略微增加，而4.0% EYPNs组的粒径快速增加，且在结束时增至0 d时的约2 倍。PDI结果显示，除了4.0% EYPNs组增大至0.417，其他样品都小于0.3，表明样品具有较为均一的粒径分布。所有样品经储存1 个月后外观无明显变化，未发生聚集和沉淀，只有4.0% EYPNs组的样品颜色轻微变浅。以上结果表明，除4.0% EYPN组的复合纳米颗粒发生了轻微聚集外，其他样品都显示出良好的胶体稳定性。

4 EYPNs-Cur的冻干复溶性

Cur在水溶液中的稳定性较差，短时间内会迅速发生降解，并呈pH值依赖性：在pH值为3.0～6.5时，Cur的半衰期为100～200 min；在pH值为7.2～8.0时，Cur的半衰期急剧缩短至1～9 min。因此，评价Cur在储存期间的保留率至关重要。Cur封装于EYPNs中大大提高了其降解稳定性。在25 ℃下不避光贮藏1 个月后，EYPNs-Cur中的Cur含量基本未发生改变，只在3.0%、4.0% EYPNs组出现了Cur轻微降解（溶解度分别为322.25～288.00、434.35～393.25 μg/mL）的情况，但其Cur保留量依然高达90%左右。这主要是由于当EYPNs荷载的Cur量较大时，在25 ℃透明玻璃瓶中不可避免地受光照的影响使部分Cur发生降解。本研究中构建的EYPNs-Cur可以有效保护Cur免受光照和氧化剂等的影响而降解。可能的稳定机制如下：一方面归因于两亲性EYP自身具有一定的抗氧化能力；另一方面，EYPNs与Cur相互作用所结合，起到了“固定”Cur的作用，降低其迁移率，从而降低了其化学反应性；此外，结合XRD结果，Cur被完全封装于EYPNs的胶束内部，形成了物理屏障，从而保护Cur不被降解。

在室温25 ℃不避光条件下，EYPNs-Cur已经显示出良好的储存稳定性，但较高浓度纳米颗粒的粒径会有所增加，为了更好地实现纳米颗粒的长期稳定，进一步考察低温贮藏条件下EYPNs-Cur的粒径分布及Cur溶解度变化情况，结果如图5所示。所有样品在4 ℃下贮藏1 个月后，粒径均无明显变化，范围为105～135 nm，且PDI变化也很小，PDI最高不超过0.24，这表明在低温条件下储存，所有样品都具有优异的胶体稳定性。此外，EYPNs-Cur的外观在储存1 个月后与第1天相比无肉眼可见的差异。所有复合纳米颗粒的Cur几乎没有发生降解，表明低温贮藏能有效抑制Cur的降解，这主要是由于低温可以抑制复合纳米颗粒奥斯瓦尔德熟化过程和降低Cur的氧化速率。

5 EYPNs-Cur的冻干复溶性

本实验考察了冻干后EYPNs-Cur的粒径分布和Cur溶解性情况，以评估EYPNs-Cur的冻干稳定性。与冻干前相比，复溶后的EYPNs-Cur溶液外观无明显变化，整体均一澄清，无肉眼可见的聚集、沉淀出现，呈现出良好的再分散性，且同一EYPNs质量分数组的样品复溶后的溶解性与冻干前无明显差异。粒径分布的结果也与冻干前基本一致，这表明冻干过程对复合纳米颗粒的胶体分散性没有明显影响，未引发不可逆的颗粒聚集。因此，本研究制备的EYPNs-Cur可适用于多种应用场景，并且具有保存和运输条件上的优势。

6 EYPNs-Cur的生物可及性

在消化过程中脂溶性物质经过胆酸盐乳化后，可形成稳定的复合胶束并通过小肠细胞屏障进而转运到血液循环中参与多种生命活动。Cur的生物可及性主要取决于其在消化液中的溶解性，Cur含量越高表示其生物可及性越高。游离Cur和EYPNs-Cur在整个模拟消化过程中Cur保有量的变化，在模拟胃消化阶段，游离Cur和复合纳米颗粒在消化液中的生物可及性均较低，分别为0.3%～0.6%和4.4%～4.9%，虽然在数值上并不高，但EYPNs-Cur却显著高于游离Cur。在模拟肠消化阶段，两组样品在消化液中的Cur保有量均增大，游离Cur和EYPNs-Cur中的Cur生物可及性分别为30.2%～40.9%和66.3%～73.6%。相较于游离Cur，自组装形成EYPNs-Cur后，Cur的生物可及性提高近1 倍，这表明EYPNs-Cur可以显著提高Cur的生物可及性。值得注意的是，EYPNs-Cur在模拟消化过程中依然有约30%的Cur未得到利用，原因可能是EYPNs在长达1 h酸性条件下发生聚集并导致复合纳米颗粒沉淀。此外，胃蛋白酶也会水解部分EYPNs使EYPNs-Cur失稳并释放部分Cur，而Cur在酸性环境中溶解性较差。整体来看，将Cur包载于EYPNs中能大幅提升其在消化液中，增加其生物可及性。就EYPNs-Cur而言，如果采用特定的材料封装让其安全穿过胃并进入肠道内释放，其生物可及性将会大幅度提高。

7 结 论

本研究采用工业生产蛋黄卵磷脂和蛋黄油产生的副产物脱脂蛋黄蛋白粉为原料，通过胰蛋白酶水解得到两亲性EYP及其自组装形成的胶束状纳米颗粒（EYPNs），用于构建稳定的共组装EYPNs-Cur复合纳米颗粒输送体系。结果表明，EYPNs和Cur之间存在较强的疏水相互作用，Cur通过与EYPNs共组装形成纳米颗粒对Cur进行包埋，可使Cur溶解度大幅提高，同时使其即使经过长达1 个月的不避光贮藏也不发生降解。此外，Cur与EYPN共组装后的体外消化生物可及性大幅提高，由30.2%～40.9%增加至66.3%～73.6%。本研究表明，由兼具生物活性与两亲性的EYP自组装形成的纳米胶束颗粒是一种新型高效的纳米递送载体，可大幅提升疏水性功能因子的水溶性、稳定性和生物可及性，在功能性食品与营养品以及生物医药等领域具有重要的应用价值。

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