1.RT Primer的最佳选择 通常RT primer可分为三类：oligo dT,随机引物以及基因特异性引物。Oligo dT引物之所以 应用范围更加广泛，是因为可由此获得mRNA的全长拷贝。 然而如果mRNA长度过长＞4kb,或者没有polyA尾(原核mRNA或rRNA)，就需要考虑使用 随机引物进行RNA的反转录。随机引物虽能确保长基因的5'末端的转录，但并不能获得整 个基因全长的cDNAs，且对RNA样品质量要求比较高，此时可用6-8个核酸聚合体来提高 cDNAs的合成量。 而对于真核生物的qPCR，长随机引物和Oligo-dT引物的混合物似乎能给出一个漂亮的结果。 针对此类优化混合引物，已有两家公司的试剂盒或可助大家一臂之力:Qiagen QuantiTect Rev. Transcription Kit 和 BioRad iScript Kit。 第三个选择就是基因特异性引物，仅扩增需要的cDNA，适用于目的序列已知的情况。通常 在一步RT-PCR法中可使用此类引物，因为该引物也可用作为PCR中的反向引物。 2.RNA的二级结构 若要获取全长RNA的反转录，那么RNA二级结构的问题就不可忽略，因为反转录酶在遇到 此类结构后会终止反应或从模板上脱落下来。 也许你很难判断RNA是否具有二级结构，但如果基因中GC含量较高，通常意味着RNA很 难被变性且不可能是单链，此时就需要在655min对其进行充分变性，以避免其对实验结 果的影响。 另外，还有一种方法可解决此问题，即使用一种最适温度高于正常标准(37°C-42°C)的逆转 224 录酶。比如来自Life Technologies的Themoscript酶就常用于具有复杂结构RNA的逆转录。 当然也存在一些即使在常规逆转录温度(37°C-42°C)的条件下，也能跨过RNA二级结构的 高效率逆转录酶，即使是针对富集GC序列的RNA也能得到很好的结果，如Qiagen公司的 逆转录酶 Omniscript 和 Sensiscript,以及 Takara Bio 公司的 PrimeScirpt RT enzymeo 3.去除gDNA RNA中存在的基因组DNA (gDNA)污染可能是最终PCR反应中假阳性结果出现的原因，目 前已存在很多方法去除gDNA,比如通过DNAase对提取的RNA进行预处理。 以上方法无可避免会造成RNA的蛋白污染，因而这里介绍一种可绕开酶处理的方法，即针 对RNA设计一种包含内含子或内含子-外显子边界的引物，如此DNA就不会产生扩增抑或即 便扩增了其条带大小也与cDNA不同。 但值得注意的是，使用该方法时基因中要没有假基因存在，假基因(pseudogene)是插入到 基因组中剪切mRNA的DNA拷贝，否则也会产生假阳性结果。 而对于没有内含子的原核RNA，gDNA的去除则更是基因表达准确测量的一个至关重要的因 素。使用 DNAase 处理 RNA 是唯一的方法，Quantitect Rev.Transcription Kit 中所包含的 gDNA 清除缓冲液就可在无需加热或EDTA失活的条件下降解DNA。此外，具有gDNA Eraser (Takara Bio)的PrimeScript RT试剂盒也可去除gDNA，且能在不到20分钟之内快速完成RNA的cDNA 合成。 4.检测RNA分子的完整性 毫无疑问，RNA质量对cDNA合成结果会产生重要的影响，而不同批次间RNA质量差异也导 致RT-PCR产生不同的结果。所以在进行RT-PCR前，应该检查RNA条带的质量，可通过琼脂 糖凝胶电泳进行检测。通常完整的真核RNA应包括28S和18S RNA条带，且较大的条带的 强度应是较小条带的两倍左右，另外两个条带强度大致相同也是可以的。 而另一种准确测量RNA质量的方法是使用Agilent BioAnalzyer仪器，它可将RNA分子可视化 并能在分析RNA完整数值(RNA Integrity Number，RIN)后给出一个质量的量化标准。RIN为 8-10,则表示RNA质量非常好；当RIN值低于7,则说明RNA可能有降解，可能会导致一些 罕见信息的丢失等问题。 5.RNA定量 除了掌握RNA的完整性之外，准确评估产量也很重要。产量的准确性会受到以下因素的影 响：测量仪器的准确性、DNA的污染、盐的污染以及降解程度。而为了准确测量产量，小编 我更喜欢使用Nanodrop进行UV定量。 该仪器不需要稀释样品，并且具有非常宽的测量RNA的范围。以小编的经验，它可以准确 读取到10ng / ulo而传统的紫外分光光度法应避免使用大容量的比色皿，因为这需要耗费大 量的样品。此法的缺点是也可在样品中测量基因组DNA,如果从RNA提取过程残留盐或酚， 则会增加吸光度，使得RNA的0D值变得更高。 而解决此问题一个方法是使用荧光染料，Ribogreen是一种RNA特异性染料，可通过荧光来 测量RNA产量。现在，Nanodrop已经具备检测Ribogreen所发出荧光的功能。 6.两步法或一步法RT-PCR RT-PCR也分两种类型：一步法(One-step PCR)和两步法(Two-steps PCR)，具体操作见下图。 前者，RT反应和PCR扩增是在同一个反应管中进行的；而后者，RT反应与PCR扩增反应单 独进行。