作为一名生物汪，我们在研究基因的功能时，逃脱不掉的就是我们为了我们的实验目的，可能需要构建各种载体，比如表达载体，克隆载体，基因打靶载体等等。很多人在构建载体的 时候都感觉很困难，特别是对于一个刚进入实验室的新人来说那更是难上加难，完全摸不着 头脑。 那是因为其实构建载体是一个不小的工作量，需要经历很多的过程，比如首先我们需要设计引物引入酶切位点，接下来还需要经历酶切酶连等过程，只要其中的某一环节出现问题，那 最终都会导致实验失败。 我认为构建载体最关键的一步就是设计引物引入酶切位点，一旦引物设计好，那接下来就非常简单了。 1.打开snapgene软件，选择第一个（红线标记），然后输入基因的CCDS序列（基因的CCDS序列可 在NCBI数据库中获得）。 2.点击ok后界面如下，图中显示的是会切割基因编码序列的酶. 3.接下来点击最上面的Enzymes Noncutters,会显示所有不会切割基因编码序列的酶，这些酶都是我们可以用的，选酶的标准：要选择不能切割目的基因序列并且质粒上含有的酶，还有就是最好是实验室有的酶。 4.确定了可以用的酶后，接下来需要确定设计引物时用的这两种酶，确定方法：这两种酶 最好不要邻近，最好使用双酶切有共同buffer的酶，两个酶切位点最好不要是同尾酶（切下来的残基不要互补），否则效果相当于单酶切。 5.确定了所要用的酶之后，接下来需要做的就是设计引物并引入酶切位点（注意：一定要看清楚载体上promoter的方向，将CDS正向插入到promoter后面） 6.点击左下角的sequence，然后拉取上游一部分基因本身的序列，拉取的时候会显示拉取的碱基的个数以及Tm值，拉取到Tm值55度左右就可以（55度以上最好）. 7.然后点击 primer add primer， 选择 top strand. 8.点击insertions,在site位置处选择你准备引入的酶，比如我要引入EcoR I,那我就选择它，然后点击insert，这样我们就引入了该酶的酶切位点。 9.接下来需要添加保护碱基，我一般所有的酶的保护碱基都加三个，加哪个碱基没有要求,使GC含量及Tm值适中即可。 10.这样上游引物就设计好了，接下来需要检测一下引物是否会形成发卡结构，可以应用OligoCalc (http://biotools.nubic.northwestern.edu/OligoCalc.html )，如果发现会形成发卡结构，那就需要对引物序列做出一些调整，直到发卡结构消失。 11.接下来拉取基因的下游的一部分序列，用同样的方法设计好下游引物，有一点需要注 意的是，设计下游引物的时候选择bottom strand。这样构建载体所需的引物就设计好了，怎么样，是不是感觉其实也没有那么难，接下来就可以构建属于你自己的载体了。