外源酶会造成RNA的降解，造成RNA得率太低，或者彻底失败。而外源酶又是无处不在的。 这就要求注意以下三点： 注意一：严格戴好口罩，手套。手指和呼吸时重要的外源酶的来源。所以做RNA抽提的时候，还是要全副武装起来。这对自己也是一种保护措施。 注意二：实验所涉及的离心管，枪头，移液器，实验台面等要彻底处理。离心管和枪头要用 DEPC处理过，单纯的消毒灭菌可不行呀。移液器和实验台面等要用75%的酒精擦过。 注意三：实验所涉及的试剂/溶液，尤其是水，必须确保RNase-Free。 注意四：选择合适的匀浆方法。新鲜样品取材后应立即置于液氮中速冻，然后可以移至-70°C冰箱保存。在碾磨前，碾磨用具也必须预冷。在碾磨过程中，一边碾磨，一边补充液氮。样品碾碎后，在液氮刚刚挥发完时，将样品迅速转移到含裂解液的容器中，立即混匀匀浆。 注意五：选择合适的裂解液。现在市场上常用的裂解液几乎都能抑制Rnase活性。但是， 高内源酶含量的样品，如肝脏，脾脏等组织，建议使用含苯酚的裂解液。苯酚的灭活内源酶的能力是很强的。 注意六：控制好样品的起始量。如果样品的块头太大，所有的细胞无法迅速和裂解液接触。 里面没有接触到细胞的RNA很快就会被内源酶降解。所以，起始量不要太大。如果块头太 大，要把它切成小块小块的。 注意七：任何裂解液系统在接近样品最大起始量时，抽提成功率急剧下降。所以，要进行样 品的破碎和匀浆。其目的是为了使RNA彻底地完整地释放出来。如果样品是细胞，则无须破碎即可直接匀浆；如果是组织，甚至器官，那就需要破碎后才能匀浆；如果是酵母菌和细 菌，则需要先用相应的酶破壁后才能匀浆。 注意八：RNA抽提成功的唯一经济的标准是后续实验的一次成功，而不是得率。我们为什么 要抽提RNA？是为了后面的实验，例如原位杂交，免疫沉淀等等。所以，一定要明确后面到底是要干嘛？ cDNA文库构建要求RNA完整而无酶反应抑制物残留；Northern对RNA完 整性要求较高，对酶反应抑制物残留要求较低；RT-PCR对RNA完整性要求不太高，但对酶 反应抑制物残留要求严格。不用每次都以获得最高纯度的RNA为目的，从而造成不必要的浪费。