两步法或一步法RT-PCR?

RT-PCR也分两种类型：一步法(One-step PCR)和两步法(Two-steps PCR)。 前者，RT反应和PCR扩增是在同一个反应管中进行的；而后者，RT反应与PCR扩增反应单独进行。 尽管这两种方法都能得到最终的结果，但是每种方法都有优缺点。选择哪种方法取决于各种因素。如下总结它们的优缺点。 一步RT-PCR消除了样品转移步骤，不仅消除了控制物污染的潜在来源，而且需要较少的准备和操作时间。又因一步RT-PCR中所使用的引物是基因特异性的，灵敏度高，常用于分析低表达水平基因。而其不足在于同一样本中只有有限数量的目的基因被扩增，且需要在转录和扩增间寻找一个平衡。 所以当时间对实验很重要时，一般采用一步法，如检测RNA病毒，也适用于高通量分析。 由于该法的检测结果准确率高，因而在需要测量表达水平上的细微差异时，也可采用此方法。 而两步RT-PCR可将大批量的RNA转化为cDNA，然后储存cDNA用于后续实验，可检测大量基因；在分别优化RT和PCR步骤后，可更好地控制实验过程；又因只有少量的转录本被用 于PCR，则任何可能从RNA分离到RT反应的抑制剂（如乙醇、酚及胍盐等）都被稀释了。 但是两步RT-PCR更耗费时间,且带来污染的可能性更高;RT过程应以相同效率反转录RNA， 否则会影响qPCR的启动效率，进而带来不同的实验结果，因此对于每个RT反应应使用相同的条件。 如果你需要对同一样本的多个目标进行分析时，可选择两步RT-PCR。另外，当RNA的存储是个问题时，最好是进行两步RT-PCR，因为cDNA在-20°C是稳定的。